[發明專利]一種骨髓間充質干細胞細胞凍存劑

在審

• 申請號: 201710528049.8
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107232182A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 陳印平
• 申請（專利權）人: 陳印平
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及組織細胞培養技術領域，具體涉及一種一種骨髓間充質干細胞細胞凍存劑及其制備方法和應用。

背景技術

骨髓中除含有能分化發育成各種血細胞的造血干細胞之外，還含有產生非造血組織的間充質干細胞(MSCs)，因其比較容易貼壁和形成成纖維樣的克隆，因此有的文獻也把MSC、稱做貼壁細胞(成纖維細胞集落形成單位(CFU-F)。由于它們來自骨髓的支持結構，并且可以作為滋養層支持造血干細胞的生長，因此也有人稱其為骨髓基質細胞。

MSCs具有多向分化潛能已經被體內外試驗所驗證。Friedenstem首先證實了MSG、具有分化為骨、軟骨、纖維組織的能力。1999年Pittenger等從人的骼骨骨髓樣本中分離得到了MSCs，在體外不同分化條件的誘導下，可以形成成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞，并且克隆以后的細胞具有類似的分化特性，充分證明骨髓MSCs是多潛能干細胞。但是，Pittenger等人的實驗尚不能證實分離到的MSG、是否是定型祖細胞的混合物，骨髓中是否真的存在具有多向分化潛能的單個干細胞。Halleu等將分離到的間充質細胞稀釋后以低密度接種，結果由單個細胞生長而成的克隆能在體外連續擴增培養20多代，并可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞，從而證實了骨髓中分離出來的間充質細胞中含有具有干細胞特性即高度自我更新能力和多系分化潛能的單個細胞。Anita等通過使用骨髓基質細胞的克隆培養，分析185個非無限增殖的人骨髓基質細胞克隆分化為成骨、成軟骨、成脂肪細胞的能力，證實了MSCs的體外分化模型:能分化成這三個細胞系的細胞是早期的間充質祖細胞，其分化潛能的有序丟失使得分化的方向逐步減少。近20年來關于MSG、多潛能性的報道很多，這類體外研究試驗均是針對不同分化方向采用了各種不同的誘導劑，分別使MSCs向不同的終末細胞例如成骨、成軟骨、成脂肪、成肌細胞等分化。

MSCs具有取材方便，在體外培養能保持其多向分化潛能，遺傳背景穩定，植入體內無免疫排斥反應，易于臨床應用等特點，是組織工程中理想的種子細胞。雖然MSCs的多向分化潛能已經被廣泛的證實，但是它的體內試驗僅限于用小動物MSCs來修復自身的組織缺損。為了將MSCs用于大動物和與人類接近的靈長目動物，傅文玉等將培養的人骨髓MSCs注入裸鼠皮下，一個月后在注射局部觀察到了人MSCs分化的骨、軟骨、脂肪、骨骼肌、肌鍵樣組織等多種組織類型。Tippi等建立了異基因的人胎羊模型，將人MSG、植入到胎羊中，觀察到人MSCs在胎羊中存活長達13個月，并且部位特異性地分化為脂肪、軟骨、肌細胞等，進一步證實了移植以后MSCs仍具有多系分化潛能，還觀察到在人胎羊模型的損傷部位，人MSCs分化的細胞量增加，推測可能是植入的MSCs在這種損傷環境下被誘導擴增和參加組織修復或者再生反應。該研究為那些在子宮中就可以診斷出來的骨生成缺損，肌肉萎縮癥等疾病的臨床治療奠定了基礎。

MSCs比較容易從病人的骨髓中分離出來，在體外多倍擴增以后，進行多種目的性操作，然后重新輸回病人體內，其間制備好的細胞不可避免的需要冷凍保藏備用。目前，干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復雜、質量不穩定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復蘇技術成為發展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(DMSO)和血清的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO會對細胞產生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的MSCs干細胞，開展有效的MSCs干細胞凍存方法是本領域迫切的需求，建立一種長期低溫保存MSCs干細胞的方法對于促進MSCs干細胞的研宄和應用具有重大意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種骨髓間充質干細胞細胞凍存劑以及相應的制備方法及使用方法。

本發明的技術方案如下：

一種骨髓間充質干細胞細胞凍存劑，其特征在于由如下各組分組成：0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppm w/v，bFGF 1.5％w/v，維生素E 1％w/v，甘油5％v/v最后用DMEM培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-2任一所示。所述多肽由發明人通過特異性針對MSCs細胞進行的前期的大量的基因庫篩選得到，所述多肽具有保護MSCs細胞免受損傷的功能。其名稱分別為MSCs-1(SEKTWFVWYSWRKQGCIEDSRPTYHYC)、MSCs-2(KAREWEPDRHMTHWIPGFHHMGCSYH)。