[發明專利]一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法

在審

• 申請號: 201710527233.0
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107287148A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 馬榮華
• 申請（專利權）人: 蘇州北開生化設備有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N7/00
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙)32267
• 代理人: 馬廣旭

技術領域

本發明涉及一種病毒培養用的體外模型，具體地，涉及一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法。

背景技術

在病毒學的發展史中，常利用易感動物如家兔、小白鼠、豚鼠等對目的病毒進行實驗。動物模型可以觀察病毒對機體的侵害，造成病理變化的部位，但動物個體差異大，價格昂貴，還需要特殊的動物房，因此推廣起來成本巨大。隨著科學的發展，也出現了很多體外培養病毒的模型，但常規的細胞培養技術模型往往并不能反應病毒在體內的致病過程。

發明內容

發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，運用三維培養技術，既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。

技術方案：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供了一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：

（1）微載體混懸液的準備：稱取1-3份的微載體，置于玻璃容器內，按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入磷酸鹽緩沖液，混勻1-3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2-3次，再按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入新鮮的磷酸鹽緩沖液，高壓滅菌，冷卻后4℃保存；

（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻10-30分鐘，4℃保存；

（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以10⁵/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清；所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖 80-90份、碳酸氫鈉10-20份、丙酮酸鈉8-18份、絲膠蛋白3-12份、氯化鉀 30-50份、無水硫酸鎂 5-12份、氯化鈉60-80份、無水磷酸二氫鈉 8-16份、葉酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸鈉9-18份、D-泛酸鈣 0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛 0.1-0.6份、N-異丙基丙烯酰胺0.1-0.5份、亞麻酸0.3-3份、乙醇胺0.5-0.8份、芳香酸酯0.2-0.9份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份；

再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，3-4天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。

該模型的建立既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。

進一步的，上述的一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述微載體為Cytodex3。與Cytodex1/2相比，該種微載體實用性更廣，適合更多類型的細胞接種，便于多種疾病模型的建立。

進一步的，上述的一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述細胞貼壁阻滯劑為poly-hema。該阻滯劑可以有效的阻止細胞貼附在培養板底部，進而促進三維培養模型的順利建立。

進一步的，上述的一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述高壓滅菌時的溫度為120℃-140℃，滅菌時間30-50分鐘。

進一步的，上述的一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，

氯化鈉：50-80份

氯化鉀：2-5份

磷酸氫二鈉：10-15份

磷酸二氫鉀：1-5份

氯化鎂：8-10份

葡萄糖：5-10份

去離子水：40-50份。

進一步的，上述的一種新型病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，

（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10X的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整pH=7.3。