[發明專利]耐藥基因微流控芯片快速檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710525140.4
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107475364A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 蘇海峰;高亞平;屈彬彬;吳國君
• 申請（專利權）人: 北京百康芯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙)44248
• 代理人: 張立娟

技術領域

本技術屬于耐藥致病菌快速檢測領域。涉及微流控芯片快速檢測技術，提供了一種耐藥基因微流控芯片快速檢測試劑盒及檢測方法，所述耐藥基因涉及IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特定基因保守序列具有的特異性引物和引物組；還涉及將引物和引物組用于等溫擴增法檢測IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術

抗生素自1943年應用于臨床，便成為我們治療致病菌感染不可或缺的臨床藥物。最初在應對致病菌感染中抗生素是一種絕佳的藥物。但在近些年，抗生素對致病菌的治療效果越來越差，此類藥物雖然在不斷的更新迭代，更有諸多廣譜抗生素推出市場，但是細菌的耐藥性仍然是醫學界的一個難題。人體被致病菌感染后，醫生如果不能使用正確的抗生素進行治療，不僅花費了大量的治療費用，且不能達到治療的目的，還有可能殺死身體中的益生菌，使得部分條件致病菌產生致病性，甚至形成“超級細菌”。超級細菌為多重耐藥菌，對多種抗生素都有耐藥性，對許多新型廣譜抗生素也耐藥。細菌的耐藥性越強對病人的威脅就越大。

MRSA菌是一種“超級細菌”，從外界獲得mecA被認為是其青霉素耐藥的關鍵。mecA基因編碼的青霉素結合蛋白PBP2a對β-內酰胺類抗生素具有較低親和力，從而使MRSA對甲氧西林耐藥。1961年首次發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，之后在世界各地都相繼報道了MRSA感染的病例。流行病學調查顯示2004年MRSA在美國大部分醫院感染率都超過50％，而2005年又增長了30％。在我國，上世紀七十年代報道MRSA感染以來，呈逐年快速上升趨勢，2008年MRSA全國發生率為67.6％，個別地區達到80％以上。

傳統病原菌耐藥檢測是通過培養法，需要一個3-5天的培養周期，然后再通過紙片擴散法、K-B法、定量測定稀釋法來分析藥物的耐藥性，此過程檢驗周期長，需要專業的生物學人員操作。由于細菌可能在培養過程中產生耐藥，容易出現假陽性。對于患者而言，檢測周期的時間長短意味著能否得到及時治療或減少并發癥的發生。所以，在當前醫療衛生重心轉移的大背景下，在臨床上尤其是基層醫療機構對快速準確，操作簡單，實驗環境要求低的診斷產品具有迫切需求。

其中，現有技術CN102952875A提供了一種細菌耐藥基因檢測方法、基因芯片和試劑盒。該試劑盒包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測探針。該基因芯片包括檢測待測細菌耐藥基因的探針。利用該試劑盒和基因芯片進行耐藥基因檢測的方法，包括步驟：1)利用試劑盒中的引物，PCR擴增待測樣本DNA中的耐藥基因；2)擴增產物與試劑盒中的檢測探針進行熒光標記反應；3)熒光標記的擴增產物與基因芯片進行雜交，確定樣本所含耐藥基因。該方法包括核酸提取、多重PCR和熒光標記反應、基因芯片預處理、熒光標記的多重PCR產物與芯片的雜交反應、芯片掃描和結果分析五個步驟操作復雜。且每個步驟都需要諸多的儀器和苛刻的實驗環境，很容易遭成擴增產物污染，出現結果假陽性。另外與科研單位相比醫院檢驗科實驗用儀器較少，尤其是區域型小醫院沒有經費及條件購置多通道PCR儀，且該方案中原材料包括探針，探針的成本較高將導致產品售價過高，超出部分患者接受范圍不利于該試劑盒推廣。

現有技術CN104313166A一種銅綠假單胞菌多重耐藥基因液態芯片檢測試劑盒，所述銅綠假單胞菌多重耐藥基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8個耐藥基因，試劑盒包括核酸擴增組份和雜交組份；核酸擴增組份具體包括：預混液、引物混合液、聚合酶、陽性質控品、陰性質控品；雜交組份具體包括：微球雜交液、質控微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白。該方案中的探針及微球都是價格較貴的原料，熒光定量PCR儀的價格較高，需要經培訓的專業人士操作，部分醫院更沒有相關儀器，另外該方法PCR過程中設計較多升降溫過程，使得整個實驗時間周期較長。

本發明所開發的耐藥基因微流控芯片快速檢測試劑盒(恒溫擴增芯片法)，結合了恒溫擴增技術，實時熒光技術和微流控芯片技術，對下待檢耐藥樣本中的核酸進行檢測，特異性好，靈敏度高，操作簡單，檢測迅速。

發明內容