[發(fā)明專利]神經(jīng)細(xì)胞群體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710525008.3
• 申請(qǐng)日: 2017-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN107287162A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王振宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州市鹿城區(qū)中津先進(jìn)科技研究院
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司33211
• 代理人: 吳繼道

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及神經(jīng)干細(xì)胞以及培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(NS細(xì)胞或NSC)培養(yǎng)條件和方法。特別提供一種神經(jīng)細(xì)胞群體。

背景技術(shù)

雖然據(jù)說神經(jīng)干細(xì)胞可在體外分離自多種來源，但迄今仍不可能在對(duì)稱分裂、未分化狀態(tài)的大規(guī)模培養(yǎng)中擴(kuò)展細(xì)胞。從實(shí)驗(yàn)和治療觀點(diǎn)來看，都非常需要使在此狀態(tài)中長(zhǎng)期擴(kuò)展細(xì)胞。獲得的純神經(jīng)干細(xì)胞群體能夠定向分化為三種細(xì)胞類型：神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。

培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞（雖然作為不均一細(xì)胞群體的一小部分）的一種已知方法是神經(jīng)球(neurosphere)系統(tǒng)。此系統(tǒng)包括連續(xù)傳代不均一的細(xì)胞聚集體，其中僅有一小部分是真正的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)球中的大多數(shù)細(xì)胞是定型祖細(xì)胞。

有許多關(guān)于神經(jīng)球的不均一性和不穩(wěn)定性，以及它們產(chǎn)生神經(jīng)元的能力有限的報(bào)道(如Morshead等，2002)。Rappa等，Neuroscience 2003報(bào)道了以下方法：將神經(jīng)球細(xì)胞平板接種在纖連蛋白上1-7天以轉(zhuǎn)染神經(jīng)球細(xì)胞，然后重建神經(jīng)球但不提供神經(jīng)球內(nèi)干細(xì)胞（如果有）的顯著表征。

Suslov籌，2002提供了明確數(shù)據(jù)證明，神經(jīng)球系統(tǒng)太不均一，以致于不能有意義地表征其中的任何干細(xì)胞。主要結(jié)論是，神經(jīng)球內(nèi)不僅不均一一”顯示克隆內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞譜系多樣性，即除NSC以外，它們含有不同分化狀態(tài)的神經(jīng)元祖細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞”一而且不同克隆神經(jīng)球品系之間的基因表達(dá)型存在很大差異。正如論文中明確確認(rèn)的那樣，Suslov的基因表達(dá)型分析沒有建立神經(jīng)球內(nèi)干細(xì)胞的定義：一“獲得的分子表型表明我們系統(tǒng)中的產(chǎn)克隆NSC是不均一的，其中的亞組反映出不同的神經(jīng)發(fā)育定型”。

本領(lǐng)域的許多文獻(xiàn)描述了膠質(zhì)細(xì)胞的特性。Skogh等，MCN 2001描述了表達(dá)GFAP以及對(duì)RC2和干蛋白染色易變的膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物一應(yīng)注意，在體內(nèi)，放射狀膠質(zhì)中不表達(dá)小鼠GFAP (Rakic，2003)。他們報(bào)道，他們的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)的標(biāo)記Pax6 (Malatesta等，2001，2003)，他們沒有檢測(cè)到其它放射狀膠質(zhì)標(biāo)記。他們有不均一的培養(yǎng)物，沒有進(jìn)行克隆分析。

關(guān)于體外放射狀膠質(zhì)的其它報(bào)道認(rèn)為它們是分化中間體或最終產(chǎn)物。因此，Bibel等(Nat Neurosci，2004)報(bào)道了從ES絀胞通過瞬時(shí)放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元，Gregg和Weiss (JNeurosci，23：11587-601，2003；美國(guó)專利公開2003/0032181)描述了神經(jīng)球細(xì)

胞”分化”為放射狀膠質(zhì)。Hartfuss等(Dev Biol，2001)證明，放射狀膠質(zhì)存在于神經(jīng)球。Gregg和Weiss發(fā)現(xiàn)，放射狀膠質(zhì)是神經(jīng)球的分化產(chǎn)物，可以斷定“這些結(jié)果表明神經(jīng)干細(xì)胞可產(chǎn)生RGC[放射狀膠質(zhì)細(xì)胞]和成年動(dòng)物CNS中可重演(recapitulate) RGC指導(dǎo)的遷移”。流行的觀點(diǎn)是：放射狀膠質(zhì)是神經(jīng)球產(chǎn)生的分化細(xì)胞類型之一。

Liour和Yu (Glia，2003)證明，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分化可獲自ES細(xì)胞，但本領(lǐng)域的其它報(bào)道沒有提到神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)的擴(kuò)展。

Gobbel等，Brain Res 2003報(bào)道了多能大鼠細(xì)胞能增殖為“松散地粘附于基材上生長(zhǎng)的細(xì)胞的球狀簇”，即不形成均一的單層。而且，此論文的摘要斷定：“這些細(xì)胞在3次分裂中大約兩次產(chǎn)生有絲分裂后細(xì)胞，因此使擴(kuò)展困難”。他們的培養(yǎng)物中廣泛出現(xiàn)產(chǎn)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，但作者發(fā)現(xiàn)“相對(duì)少”(<3%)神經(jīng)元。他們沒有提供細(xì)胞的分子表型。

W0 01/30981描述了可分化為神經(jīng)元的細(xì)胞的培養(yǎng)物。但這些細(xì)胞是GFAP和干蛋白陽性，被描述為星形膠質(zhì)細(xì)胞，是相對(duì)不純的混合群體。干細(xì)胞需要特定細(xì)胞微環(huán)境或小生境的觀點(diǎn)是干細(xì)胞生物學(xué)中的正統(tǒng)觀點(diǎn)。雖然不總是承認(rèn)，但已知神經(jīng)球干細(xì)胞僅構(gòu)成祖細(xì)胞、母細(xì)胞和未成熟的分化后代等全部細(xì)中的一小部分。此種混合細(xì)胞類型的聚集可構(gòu)成其中可能有干細(xì)胞的小部分細(xì)胞的小生境。

文獻(xiàn)中沒有報(bào)道過由ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞的均一群體，僅產(chǎn)生可能在變?yōu)槟z質(zhì)細(xì)胞限制性之前瞬時(shí)擴(kuò)展的神經(jīng)上皮前體細(xì)胞(如Brustle等，Sclence 1999)。因此，本領(lǐng)域中存在許多問題。所有報(bào)道都承認(rèn)他們的培養(yǎng)物是不均一的。不可能用神經(jīng)球系統(tǒng)維持對(duì)稱分裂和不分化狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)大量神經(jīng)干細(xì)胞的其它嘗試沒有成功地超過5-20代，細(xì)胞高度傾向于分化乜阻礙了這些嘗試。例外是有關(guān)成年大鼠海馬干細(xì)胞的工作，但這些是染色體組型異常，并且低效率地形成神經(jīng)元。