[發明專利]一種Vero細胞的復蘇方法

在審

• 申請號: 201710524382.1
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107151650A
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發明（設計）人: 馬榮華
• 申請（專利權）人: 蘇州北開生化設備有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙)32267
• 代理人: 馬廣旭

技術領域

本發明屬于生物技術應用領域，具體地，涉及一種Vero細胞的復蘇方法。

背景技術

細胞培養是生物與健康相關研究領域的一項重要技術。隨著生命科學的迅速發展，目前細胞培養已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規律、有關疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發具有不同針對性的細胞培養方法具有重要意義。細胞復蘇是培養細胞的一種，是生命及再生醫學領域中廣泛應用的關鍵技術，在研究中往往需要對凍存的細胞進行復蘇，從而進行體內外的相關研究。

Vero細胞是日本學者1962年從非洲綠猴(cercopithecus aethiops monkey)腎建立的猴腎細胞系。其名稱的由來是取自世界語中“綠”字的VERDE前兩個字母和“腎”字前兩個字母合在一起，但世界語中不允許VERE存在，而需以“O”結尾，故命名為“Vero”。其第93代被帶到美國NIH的過敏與傳染病研究所熱帶病毒研究室，第113代被提交給ATCC，編號為ATCC NO.CCL-81。

除了常規的科研需要之外，經過全面的研究鑒定，Vero細胞具有胞核學穩定，沒有外源因子污染和致瘤性的優點，完全符合1987年WHO關于用于生物制品的傳代細胞的規程要求，并已被WHO批準可用作疫苗生產的基質。于是，Vero細胞小兒麻痹滅活疫苗、小兒麻痹活疫苗、Vero細胞狂犬病疫苗相繼在法國被研制出來并獲批準生產。因此，Vero細胞的應用前景以及需求量極大。

發明內容

發明目的：本發明提供了一種Vero細胞的復蘇方法。

技術方案：本發明提供了一種Vero細胞的復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的Vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有Vero細胞專用凍存液的Vero細胞液完全融化將Vero細胞液加入到盛有2-3ml新鮮Vero細胞專用培養基的離心管中，用移液槍上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的轉速下離心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鮮Vero細胞專用培養基，用移液槍上下吹打40-50次，然后均勻的加入到盛有7-9ml的新鮮Vero細胞專用培養基，于37℃，5%CO₂培養箱中培養；所述Vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、維生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷0.8-2份和基礎培養基80-90份。本發明所述的Vero細胞的復蘇方法，方法合理，能夠去除凍存劑對復蘇后細胞生長的影響，復蘇后的Vero細胞存活率高，細胞生長速度快，細胞狀態好，邊界清晰，可以有利于乳腺癌轉移的相關研究。其中，Vero細胞專用凍存液對細胞損傷小，20%甘露醇為滲透性保護液，而(S)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷則抑制細胞活動和基因表達，維生素E的抗氧化性好，在保證休眠Vero細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態。

進一步的，上述的Vero細胞的復蘇方法，所述Vero細胞專用培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清。Vero細胞專用培養基，組分合理，可以進一步為復蘇的細胞的提供營養物質。

進一步的，上述的Vero細胞的復蘇方法，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖 80-90份、碳酸氫鈉 10-20份、丙酮酸鈉8-18份、人血白蛋白2-10份、氯化鉀 30-50份、無水硫酸鎂 5-12份、氯化鈉60-80份、無水磷酸二氫鈉 8-16份、PHA-植物血球凝集素0.2-1份、葉酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸鈉9-18份、D-泛酸鈣 0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛 0.1-0.6份、還原谷胱甘肽 0.1-0.8份、膽固醇1-5份、抗壞血酸磷酸酯0.5-1.2份、聚碳酸酯0.3-1.5份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份。