[發明專利]一種檢測核酸內切酶酶切位點的方法有效
| 申請號： | 201710522336.8 | 申請日： | 2017-06-30 |
| 公開（公告）號： | CN109207571B | 公開（公告）日： | 2022-01-04 |
| 發明（設計）人： | 李卓坤;徐東洋;楊晉;顧穎;黎宇翔;陳奧;徐崇鈞;章文蔚 | 申請（專利權）人： | 深圳華大生命科學研究院 |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 | 代理人： | 關暢 |
| 地址： | 518083 廣東省深圳市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 檢測 核酸 內切酶酶切位點 方法 | ||
1.一種檢測核酸內切酶酶切位點的方法，包括如下步驟：
（a1）構建待測序的文庫，并將所述文庫固定到芯片上，得到待測序的芯片；
（a2）將所述待測序的芯片進行第一次測序，得到第一次測序后的芯片，并獲得每條核酸序列的序列信息及ID號；
（a3）洗脫所述第一次測序后的芯片，將第一次測序生成的新鏈洗脫掉，得到洗脫后的芯片；
（a4）將所述洗脫后的芯片進行第二次測序，得到第二次測序后的芯片，并拍照獲得對應DNA序列位點的熒光信號和ID號；
（a5）用核酸內切酶對所述第二次測序后的芯片上的DNA序列進行酶切，酶切反應后進行洗脫，去除被切割的DNA序列，得到酶切后的芯片，并拍照獲得對應DNA序列位點的熒光信號和ID號；
（a6）將步驟（a4）與步驟（a5）獲得的熒光信號進行對比，獲得發生酶切反應的DNA序列的ID；
（a7）根據所述發生酶切反應的DNA序列的ID，分析發生酶切反應的DNA序列，獲得切割位點的序列信息；
所述第二次測序最后兩個循環為常規測序反應，其余循環的測序反應添加的dNTP僅攜帶可逆阻斷基團不攜帶熒光基團；
所述第一次測序和所述第二次測序均采用邊合成邊測序的測序方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（a1）中的方法均是基于邊合成邊測序技術的測序平臺。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述第二次測序的循環數不大于所述第一次測序的循環數。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一次測序共進行10-300個循環的常規測序反應，所述第二次測序共進行10-300個循環的測序反應。
5.根據權利要求4中所述的方法，其特征在于：所述第一次測序反應進行的循環數和所述第二次測序反應進行的循環數均為50。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述新鏈洗脫采用的試劑為100%的甲酰胺。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述核酸內切酶為EcoRI。
8.權利要求1-7任一所述的方法在如下1）-4）中任一種中的應用：
1）檢測核酸內切酶的識別切割位點的傾向性；
2）預測核酸內切酶的星號活性；
3）預測基因組編輯技術中內切酶的脫靶效應；
4）大規模篩選新型基因組編輯系統中使用的內切酶所需要識別的PAM序列。
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