[發明專利]一種淀粉蔗糖酶及其用于轉化生產α?熊果苷的方法

在審

• 申請號: 201710521804.X
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107267478A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 沐萬孟;江波;王永春;張濤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/44;C12P19/18;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙)32104
• 代理人: 時旭丹,張仕婷

技術領域

本發明涉及一種淀粉蔗糖酶及其用于轉化生產α-熊果苷的方法，屬于食品生物技術領域。

背景技術

熊果苷(arbutin)屬氫醌苷化合物，化學名為4-羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質。酪氨酸酶催化了“酪氨酸-DOPA-黑色素”的黑色素生成反應，熊果苷作為一種安全有效的酪氨酸酶抑制劑可以有效解決黑斑、老年斑、雀斑以及長時間暴露日光所造成的皮膚損傷。熊果苷有兩種同分異構體分別為α-熊果苷和β-熊果苷，相關研究表明α-熊果苷對酪氨酸酶的抑制效果是β-熊果苷的十倍，而且對正常的人體細胞沒有抑制作用，安全性也遠遠高于β-熊果苷。

傳統的化學合成法合成α-熊果苷，存在步驟多、純化復雜的問題。近年來報導了很多酶法合成的方法，如α-amylase, α-glucosidase, sucrose phosphorylase, tranglucosidase, dextransucrase，存在底物相對較貴或轉化率低的問題。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一種淀粉蔗糖酶及其用于轉化生產α-熊果苷的方法。

本發明的技術方案，一種淀粉蔗糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID No.2。

其來源于Cellulomonas carboniz T26（登錄號：KGM11272.1）的重組淀粉蔗糖酶，其基因核苷酸序列為SEQ ID No.1。

所述淀粉蔗糖酶的表達方法如下：人工合成基因SEQ ID No.1，兩端設計NdeI和Xho I限制性內切酶識別序列，酶切處理后連接到載體pET-22b(+)上獲得pET-CC-AS重組質粒，再轉化至感受態大腸桿菌BL21中，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選到陽性克隆，獲得基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS。

具體步驟如下：

（1）重組表達載體pET-CC-AS的構建：合成帶Nde I/Xho I酶切位點的Cellulomonas carboniz T26的淀粉蔗糖酶基因SEQ ID No.1連接到pET-22b(+)得到pET-CC-AS質粒；

（2）基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS的獲得：100μL BL21感受態細胞懸液中加入5μL pET-CC-AS質粒（40ng/μL），輕輕混勻；

冰浴靜置30min，質粒轉化后，均勻涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養12h得到陽性克隆，命名為重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-CC-AS；

（3）重組淀粉蔗糖酶的獲得：用兼性厭氧的大腸桿菌基因工程菌表達Cellulomonas carboniz T26菌（登錄號：KGM11272.1）的淀粉蔗糖酶基因AS，種子在含氨芐青霉素的LB培養基中活化，再接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB培養基中震蕩培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至1mM，溫度28℃誘導表達6h獲得重組酶的大量可溶性表達物，離心獲得菌體以后超聲破碎，破碎上清液過Ni²⁺層析柱獲得純化后的重組淀粉蔗糖酶；

挑取基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS單克隆至含氨芐青霉素50μg/mL的LB種子培養基中，37℃、200rpm震蕩培養12h；

以1︰50比例將種子培養液接入發酵培養基37℃培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，加IPTG至終濃度1mM；

溫度28℃、200rpm誘導表達6h，收集菌液；4℃、10000rpm離心10min收集菌體，棄去上清，生理鹽水洗滌3次；

離心獲得菌體以后超聲破碎，按1g菌體︰20mL平衡緩沖液的比例加入平衡緩沖液，冰浴超聲破碎；細胞超聲破碎條件為功率200W，總時間15min，每破碎1s間歇3s，4℃、10000rpm離心30min去除細胞碎片；

過金屬親和層析色譜得到純化后重組淀粉蔗糖酶：離心后上清過Chelating Sepharose Fast Flow親和介質層析柱，低咪唑洗脫緩沖液洗脫雜蛋白，高咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白；

目的蛋白過脫鹽柱脫鹽以后，超濾濃縮獲得重組淀粉蔗糖酶酶液，真空冷凍干燥獲得淀粉蔗糖酶純酶粉；

其中，平衡緩沖液的成分：pH7.0的含50mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉及500mM氯化鈉的緩沖液；