[發明專利]葡萄糖氧化酶突變體

有效

• 申請號: 201710520354.2
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN109207446B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 袁延文;吳秀秀;邵弨;王華明
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明涉及蛋白質工程技術領域，具體提供了一種葡萄糖氧化酶突變體。本發明提供的葡萄糖氧化酶三點突變體GOD?K在70℃處理2.5min后殘余酶活為68.20％，75℃處理2.5min后殘余酶活為42.76％，比兩點突變體GOD11分別提高了19.3％和38.1％，取得了意料不到的效果,更適合在工業生產中的應用，因而市場前景廣闊。

技術領域

本發明涉及蛋白質工程技術領域，具體涉及一種葡萄糖氧化酶突變體及其應用。

背景技術

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4,GOD)在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶是同型二聚體分子，含有2個黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結合位點。每個單體含有2個完全不同的區域：一個與部分FAD非共價但緊密結合，主要為聲折疊；另一個與底物β-D-葡萄糖結合，由4個α-螺旋支撐1個反平行的β-折疊。

葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物和微生物體內。但動植物組織中葡萄糖氧化酶含量有限，而微生物由于具有來源廣泛、生長周期短等優點被廣泛用作生產葡萄糖氧化酶的來源。但通常天然菌株產葡萄糖氧化酶水平不高，難以直接用來生產葡萄糖氧化酶。一方面我們可以通過菌株誘變、優化菌株的發酵條件等傳統方法，獲得葡萄糖氧化酶高產菌株；另一方面，通過基因重組等方法獲得葡萄糖氧化酶高產菌株，采用重組工程菌獲得葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶在工業生產中有諸多用途，在食品工業中，能夠除氧保鮮，去葡萄糖，經過精制的葡萄糖氧化酶，可以用于醫療診斷,如比色血糖試紙和基于生物傳感器的血糖檢測儀。在飼料工業中，作為飼料添加劑，葡萄糖氧化酶可以解除腸道霉菌毒素中毒，減少飼料霉菌超標危害；同時，葡萄糖氧化酶催化動物腸道內的葡萄糖產生葡萄糖酸，葡萄糖酸可降低胃內食糜pH值，有效抑制有害菌繁殖，促進有益菌生長，還能激活胃蛋白酶活性，有利于蛋白質、維生素、礦物質等營養成分的消化吸收，從而提高飼料轉化效率；添加了葡萄糖氧化酶的畜禽飼料可以通過清除動物因應激反應產生的自由基，保護腸道上皮細胞完整，阻擋病原體入侵。

然而，在飼料加工過程中的短暫高溫過程會造成葡萄糖氧化酶的失活，影響葡萄糖氧化酶的應用效果，在葡萄糖氧化酶產量得到保證的前提下，葡萄糖氧化酶的耐溫性能越來越受到關注，因此，通過基因工程手段開發耐溫性強的葡萄糖氧化酶迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的是提供一種葡萄糖氧化酶突變體，其耐熱性得到顯著提高，有利于其在飼料領域的廣泛應用。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種葡萄糖氧化酶突變體，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一個：

(Ⅰ)與葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的序列；

(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一個免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互補序列或因遺傳密碼的簡并性而與如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互補序列的核苷酸序列不同的序列編碼的氨基酸序列；

在本發明的一些實施例中，所述取代為取代2個或2個以上氨基酸。

在本發明的另一些實施例中，所述取代包括氨基酸序列為SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位和第416位氨基酸同時發生了取代。

在本發明的另一些實施例中，所述取代包括氨基酸序列為SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位氨基酸由A變為R,第416位氨基酸由A變為K。

在本發明的另一些實施例中，所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：4。