[發(fā)明專利]組蛋白去乙酰化酶抑制劑在細胞培養(yǎng)中的用途及細胞培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710518172.1
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107142238B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳留芳;李程;茅永智
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州觀梓健康科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11447
• 代理人: 耿超,王浩然

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地，涉及一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑在細胞培養(yǎng)中的用途及細胞培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)在體外特定生長因子誘導下可定向分化得到肝臟細胞，是肝臟細胞生物功能分析、藥物篩選、毒理檢測、體內(nèi)移植等操作的潛在的重要細胞來源。但目前由多能干細胞分化所得到的肝臟細胞大都存在以下缺陷：1)細胞成熟性不夠，分化得到的肝臟細胞大都處于發(fā)育的幼稚期，表現(xiàn)為幼稚肝臟細胞標示物AFP(alpha fetal protein)蛋白水平較高，一些解毒酶(如CYP3A4)活性較低等；2)細胞群體處于雜合狀態(tài)，體外分化效率無法達到100％，在主要細胞群體外混雜有多種其他細胞類型，表現(xiàn)為肝臟細胞標示物(如albumin白蛋白)染色比例<100％；3)不同多能干細胞株系的定向分化效率相差較大，不同多能干細胞株系建立方法和來源差異以及遺傳和表觀遺傳背景差異，導致不同株系分化得到不同功能體細胞的體外分化效率相差很大，表現(xiàn)為不同干細胞株分化后得到的肝臟細胞在成熟標記物(如albumin白蛋白)表達水平和表達細胞比例相差較大。

由于上述問題的存在，多能干細胞分化得到的肝臟細胞在基礎(chǔ)科研和轉(zhuǎn)化醫(yī)學方面的應用受到較大限制。為進一步改善體外分化體系，提高所得肝臟細胞的質(zhì)量，需要對體外分化體系進行針對性的改進。

另一方面，體外培養(yǎng)的原代肝臟細胞(來源于人、鼠或其他模式動物肝臟組織)在培養(yǎng)較短時間內(nèi)肝臟細胞特征會有大量丟失，表現(xiàn)為細胞形態(tài)變化，肝臟標示物(如albumin)表達水平等顯著下降。為解決該問題，需要進一步改善原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)體系，減緩原代肝臟細胞肝臟特征的丟失。

目前用于改進肝臟細胞體外定向分化體系和原代細胞培養(yǎng)體系的方法主要有兩種，第一種是通過調(diào)整生長因子或化合物的使用對體外分化體系或培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，該方法的缺陷在于使用的生長因子和化合物種類來源有限制，且往往價格較貴；第二種方法是優(yōu)化體外二維培養(yǎng)體系，通過增加滋養(yǎng)層細胞或利用三維培養(yǎng)體系，對體外分化體系或培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，該方法的缺陷在于需要復雜的培養(yǎng)體系，體系的復雜程度高也導致可變因素増多、培養(yǎng)難度大且難以保證細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和安全性。

發(fā)明內(nèi)容

本公開的目的是克服現(xiàn)有的肝臟細胞體外定向分化誘導技術(shù)和原代肝臟細胞體外培養(yǎng)技術(shù)中存在的上述缺陷，提供一種簡便、高效的肝臟細胞體外定向分化及原代肝臟細胞體外培養(yǎng)技術(shù)。

為達到以上目的，本公開的第一個方面提供組蛋白去乙酰化酶抑制劑在細胞培養(yǎng)中的用途，其中，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)或原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)。

可選的，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為CI-994(Tacedinaline，CAS號：112522-64-2)、MS-275(Entinostat，CAS號：209783-80-2)、FK228(Romidepsin，CAS-號：128517-07-7)。

可選的，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)，包括在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/L的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。

可選的，所述的用途包括以下步驟：

(1)將多能干細胞在含有激活素A和/或P13K抑制劑的第一誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得內(nèi)胚層細胞；

(2)將所述內(nèi)胚層細胞在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和/或成纖維生長因子2的第二誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得肝臟祖細胞；

(3)將所述肝臟祖細胞在含有肝細胞生長因子的第三誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不成熟肝臟細胞；

(4)將所述不成熟肝臟細胞在含有5-10μmol/L的組蛋白去乙酰化酶抑制劑以及制瘤素M、肝細胞生長因子和地塞米松的第四誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得肝臟細胞。

可選的，所述用途為原代肝臟細胞體外培養(yǎng)，包括在含有工作濃度為5-10μmol/L的組蛋白去乙酰化酶抑制劑的原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基中進行原代肝臟細胞體外培養(yǎng)。

可選的，所述原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基的組成成分包括：在基礎(chǔ)原代肝臟培養(yǎng)基中添加5-10μmol/L的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。

本公開的第二個方面提供一種多能干細胞向肝臟細胞體外定向分化培養(yǎng)體系，其中，在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/L的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為CI-994、MS-275或FK228。

可選的，所述培養(yǎng)體系包括：