[發(fā)明專利]一種表達H9亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710517830.5
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107142280A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳艷濤;張小榮;杜元釗;楚電峰
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué);青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/869
• 分類號: C12N15/869;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達H9亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株。

背景技術(shù)

我國自1994年首次報道從雞群中分離到H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)以來，該亞型禽流感在我國一直呈地方性流行，嚴重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。H9亞型AIV傳播能力強，流行范圍廣，感染家禽主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，該亞型病毒雖然對雞低致病性，但并發(fā)或繼發(fā)感染其他病原可引起高發(fā)病率和死亡率，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

目前滅活疫苗的使用成為預(yù)防和控制禽流感的主要手段，但常規(guī)的滅活疫苗存在著一些難以克服的缺陷：滅活疫苗生產(chǎn)費時費力，且油乳佐劑會引起局部的不良反應(yīng)，導(dǎo)致動物不適和肉質(zhì)下降；不能誘導(dǎo)有效的細胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫IgG抗體的產(chǎn)生，因而無法有效地抑制呼吸道中流感病毒的復(fù)制；免疫效率低下，免疫劑量大，不能與自然感染區(qū)分，影響禽流感的監(jiān)控，而且存在著散毒的危險等。因此，急需研制新型禽流感疫苗來克服現(xiàn)有疫苗的不足。而基因重組活載體疫苗在很大程度上可以避免上述情況。

目前用于構(gòu)建重組病毒的活載體有很多，如馬立克氏病毒(MDV-1)、火雞皰疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、鴨瘟病毒(DEV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞痘病毒(FPV)等。與其他禽病毒載體相比，HVT具有很多獨特的優(yōu)勢。其優(yōu)勢主要包括：HVT有20多個可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)，因此其復(fù)制非必需區(qū)可以插入較長外源基因，有利于構(gòu)建多價重組活疫苗，其中已報道的復(fù)制非必需區(qū)有US1、US2、US3、US6、US10、US7、UL23、UL44、UL45、UL46、TK、PK等；HVT可在雞體內(nèi)持續(xù)感染，為外源基因的表達提供良好的活載體，可以刺激機體持續(xù)的產(chǎn)生抗體；HVT作為疫苗對雞無致病性，不影響其生產(chǎn)性能，安全性好；HVT可刺激機體產(chǎn)生堅強的細胞免疫反應(yīng)，且持續(xù)時間長，接種一次可達到終生免疫的效果；HVT具有很強的細胞結(jié)合特性，可以在細胞間傳播；以HVT為載體的基因工程苗可以突破母源抗體的干擾等。因此，以HVT為載體的基因工程苗具有廣闊的應(yīng)用前景。

就AIV而言，HA蛋白作為主要免疫保護性抗原，是體液免疫的靶抗原，主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，因此如何能夠以火雞皰疹病毒(HVT)為載體進行H9亞型禽流感病的活疫苗研究成為一項亟待攻克的難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種表達H9亞型禽流感病毒HA基因重組火雞皰疹病毒株，該病毒株可用于家禽中誘導(dǎo)針對H9亞型AIV的保護性免疫應(yīng)答。

本發(fā)明首先提供一種在火雞皰疹病毒中插入外源基因的方法，是將外源基因插入火雞皰疹病毒(HVT)的兩個插入位點US2和US10，

更具體的，所述的插入位點位于HVT基因組US2區(qū)的140276nt-140285nt之間。

本發(fā)明再一方面提供一種重組火雞皰疹病毒，是通過在火雞皰疹病毒的US2區(qū)和US10區(qū)分別插入H9亞型禽流感病毒HA基因和H9亞型禽流感病毒的HA2基因構(gòu)建的；

本發(fā)明所提供的表達H9亞型禽流感病毒HA基因重組火雞皰疹病毒(rHVT-H9-HA)株，于2017年1月18日保藏在位于中國武漢、武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:V201707。

本發(fā)明的rHVT-H9-HA株用于表達HA基因蛋白，

本發(fā)明的rHVT-H9-HA株的另一方面的用途是用于制備疫苗；

本發(fā)明以火雞皰疹病毒(HVT)FC-126疫苗毒株為載體，分別以其復(fù)制非必需區(qū)US2和US10為插入位點，構(gòu)建表達EGFP標記基因的重組病毒rHVT-EGFP。本發(fā)明選擇H9亞型禽流感病毒YZ140706株的HA基因完整的開放閱讀框和HA2基因分別構(gòu)建表達盒，再次利用同源重組原理，用上述兩個基因表達盒分別替換重組病毒rHVT-EGFP的標記基因eGFP，分別篩選出表達完整HA基因和部分HA基因的重組HVT。

免疫保護評價結(jié)果表明，本發(fā)明的rHVT-H9-HA株對H9亞型禽流感病毒，可以提供100％攻毒保護。

附圖說明

圖1：轉(zhuǎn)移的構(gòu)建模式圖；

圖2：重組病毒rHVT-H9-HA的構(gòu)建示意圖；

圖3：HA基因及其表達盒PCR電泳圖；

圖4：重組病毒rHVT-EGFP的熒光圖；

圖5：重組病毒rHVT-H9-HA的噬斑圖；

圖6：鑒定重組病毒rHVT-H9-HA外源基因表達的IFA試驗；