[發明專利]一種產羥基脂肪酸的工程菌株及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710515975.1
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107177541A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 萬霞;肖康;陳文超;王煉;徐琳;龔陽敏;黃鳳洪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/29;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及微生物領域，特別涉及一種產羥基脂肪酸的工程菌株及其制備方法和應用。

背景技術

羥基脂肪酸(HFAs)是脂肪酸分子長鏈碳位非羧基碳原子上具有單個或多個羥基的一類有機羧酸，廣泛存在于植物、動物以及微生物中。近年來研究發現羥基脂肪酸具有一系列的生理作用，如抗菌性、抗炎性和抗糖尿病等。與常規脂肪酸相比，HFAs中羥基的存在使得它們具有一些特殊的性質，如HFAs具有較高的活性、黏性、穩定性和溶劑混溶性，在食品、化工、制藥、化妝品等行業具有廣泛的用途，尤其是ω-HFAs可以作為合成綠色聚合物材料的理想原料，合成的聚合物能夠對高溫和化學制品具有耐受力，并具有一定的彈性和較高的生物相容性，安全無毒，因此受到人們的青睞。

自然界中的羥基脂肪酸主要來自蓖麻種子中的蓖麻油酸。但蓖麻種子還含有劇毒物質蓖麻毒蛋白和一些過敏原蛋白，這為栽培、收獲、貯運及加工蓖麻帶來諸多不便，這使得由自然界中獲得的羥基脂肪酸已經遠不能滿足人們的需求，為了克服上述缺陷，人們采用化學法合成羥基脂肪酸。

在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題：

化學法合成羥基脂肪酸由于合成的羥基脂肪酸羥基位點特異性差，反應中需要使用強酸強堿因而對環境造成污染等，使化學法合成羥基脂肪酸受到了一定的局限。

發明內容

為了解決現有技術中化學法合成羥基脂肪酸羥基位點特異性差且污染環境的問題，本發明實施例提供了一種產羥基脂肪酸的工程菌株及其制備方法和應用。所述技術方案如下：

一方面，本發明實施例提供了一種產羥基脂肪酸的工程菌株，所述工程菌株包括：P450_BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸調控因子fadR，所述P450_BM3基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述硫脂酶基因為序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述脂肪酸調控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

另一方面，本發明實施例提供了一種制備上述工程菌株的方法，所述方法包括：

將所述P450_BM3基因和所述硫脂酶基因分別連接到第一表達載體上，得到第一重組表達載體。

將所述脂肪酸調控因子fadR連接到第二表達載體上，得到第二重組表達載體。

將所述第一重組表達載體和所述第二重組表達載體共同轉入感受態細胞中，得到重組菌株，即所述工程菌株。

具體地，所述感受態細胞為敲除了fadD基因的大腸桿菌感受態細胞。

具體地，所述將所述P450_BM3基因和所述硫脂酶基因分別連接到第一表達載體上，得到第一重組表達載體，包括：

采用限制性內切酶EocRI和限制性內切酶NotI分別對所述P450_BM3基因與所述第一表達載體進行雙酶切，將酶切后的所述P450_BM3基因與酶切后的所述第一表達載體連接，得到第一連接產物。

采用限制性內切酶BglII和限制性內切酶XhoI分別對所述第一連接產物和所述硫脂酶基因進行雙酶切，將酶切后的所述硫脂酶基因與酶切后的所述第一連接產物連接，得到第一重組表達載體。

進一步地，所述第一表達載體為pACYCDuet-1。

具體地，所述將所述脂肪酸調控因子fadR連接到第二表達載體上，得到第二重組表達載體，包括：

采用限制性內切酶BamHI和限制性內切酶HindIII分別對所述脂肪酸調控因子fadR和所述第二表達載體進行雙酶切，得到酶切后的所述脂肪酸調控因子fadR和酶切后的所述第二表達載體，將所述酶切后的脂肪酸調控因子fadR與酶切后的所述第二表達載體連接，得到所述第二重組表達載體。

具體地，所述第二表達載體為載體pET-28a(+)。

又一方面，本發明實施例提供了一種上述工程菌株在合成羥基脂肪酸中的應用，所述應用包括：

活化所述重組菌株。

發酵活化后的所述重組菌株，并加入誘導劑進行誘導，得到誘導產物。

在所述誘導產物中提取羥基脂肪酸，得到所述羥基脂肪酸。

具體地，采用發酵培養基發酵活化后的所述重組菌株，所述發酵培養基為含有抗生素和濃度為0.5％的葡萄糖的M9培養基，其中，所述抗生素包括濃度50μg/mL的卡納霉素和濃度為34μg/mL的氯霉素。

進一步地，所述發酵培養基還包括濃度為2％的甘油。