[發明專利]用于檢測DPYD*2A遺傳多態性的引物、探針及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710514619.8
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107058608A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 莊江興
• 申請（專利權）人: 莊江興;廈門市同普生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙)35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及體外核酸檢測，尤其是涉及采用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術檢測DPYD*2A基因多態性的引物、探針及檢測試劑盒。

背景技術

二氫嘧啶脫氫酶(dihydropymidine dehydrogenase，DPD)是氟尿嘧啶(5-FU)藥物代謝途徑中的關鍵性酶之一，可催化5-FU在形成細胞毒作用的核酸之前代謝成無抗癌活性的代謝產物，是5-FU代謝失活的限速酶。DPD由二氫嘧啶脫氫酶基因(DPYD)編碼產生，DPYD基因定位于染色體lp22上，全長約950kb，包括23個外顯子。DPYD序列上堿基的突變可能引起DPD結構及活性的改變，DPD活性缺乏與氟化嘧啶類化療藥物毒性反應密切相關，而DPYD突變則對DPD結構及活性起著重要的作用。

氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱和替加氟都為嘧啶類似物，屬抗代謝類抗腫瘤藥物?？ㄅ嗨麨I為5-FU的前體，在體內可活化代謝為5-FU，用于結腸癌和對紫杉醇及多柔比星等無效的晚期乳腺癌的治療。替加氟為5-FU的衍生物，在體內經肝臟活化轉變為5-FU而發揮抗腫瘤作用。85％的5-FU經二氫嘧啶脫氫酶(DPD)代謝滅活。DPD酶活性低下的結腸癌和胃癌患者應用5-FU、卡培他濱或替加氟后出現體內5-FU蓄積，引起嚴重粘膜炎、粒細胞減少癥、神經系統癥狀甚至死亡。

DPYD基因14外顯子1986位A>G多態性(DPYD*2A)是最常見的引起酶活性下降的遺傳變異，等位基因攜帶率為3％。約40％低DPD酶活性的個體攜帶DPYD*2A等位基因，其中有60％的患者應用5-FU治療后出現4級嚴重的粒細胞減少；而在DPD酶活性正?；颊咧?，5-FU所致嚴重毒副反應的發生率僅為10％。因此，對DPYD*2A多態性進行檢測可預測5-FU治療導致致命性毒性反應發生風險。FDA已批準在5-FU說明書中增加在用藥前對DPYD多態性進行檢測的建議。CPIC指南也建議在應用5-FU、卡培他濱和替加氟前對DPYD多態性進行檢測，攜帶DPYD*2A等位基因的患者慎用5-FU、卡培他濱和替加氟，或降低用藥劑量，以避免嚴重不良反應或毒性的發生。

目前常用的基因分型方法大致可分為三類：一是基于凝膠電泳的技術，如PCR反應結合限制性酶切片段長度多態性分析(RFLP)、多重PCR、等位基因特異性擴增等；二是基于熒光標記雜交反應的基因分型技術，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法DNA測序、直接雜合子測序以及等位基因特異性引物延伸等。以上二種方法都是在PCR擴增反應之后，再采取不同的方法檢測多態性位點。三是基因芯片技術，基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。基因芯片技術由于高通量等優點在SNP檢測中得到大量應用，但也存在檢測時條件難以控制、重復性差、準確性低、易出現假陽性、假陰性結果、靈敏度較低等缺點。此外，還有磁珠/PCR熒光探針法、怛溫擴增法、PCR溶解曲線法、PCR+導流雜交法等方法。上述各種方法都具有各自的優缺點及適用性。

目前采用熒光定量PCR法對DPYD*2A基因多態性的檢測主要有染料法與探針法兩種方式。染料法即在反應體系中加入雙鏈DNA嵌入染料如SYBR Green I以指示目標片段的擴增。然而由于染料不具序列物異性，因此只能進行單重PCR，這不僅使通量變低，而且必須依靠熔解曲線分析區分目標片段與二聚體。而目前探針法同樣為的單重PCR，通量低。

發明內容

本發明的第一目的在于提供用于檢測基因DPYD*2A(rs3918290)多態性的引物。

本發明的第二目的在于提供用于檢測基因DPYD*2A(rs3918290)多態性的探針。

本發明的第三目的在于提供用于檢測基因DPYD*2A(rs3918290)多態性的檢測試劑盒。

所述用于檢測基因DPYD*2A(rs3918290)多態性的引物如下：

DPYD*2A-F:5’-CAGTGAGAAAACGGCTGCAT-3’

DPYD*2A-R:5’-CATCAGCAAAGCAACTGGCA-3’。

所述用于檢測基因DPYD*2A(rs3918290)多態性的特異識別探針序列及標記的熒光染料如下：

FAM-5’-TGACTTTCCAGACAACGTAAGTGTG-3’BHQ1

HEX-5’-TGACTTTCCAGACAACATAAGTGTGAT-3’-BHQ1。