[發(fā)明專利]一種農桿菌介導的麻竹轉化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710513446.8
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107190019B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 朱強;葉善汶;蔡昌楊;唐曉珊;朱彩萍;尹騰飛;張麗
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;林文弘

1.一種農桿菌介導的麻竹轉化方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

（1）外植體的準備：取生長于溫室中的麻竹幼嫩莖端，洗滌、滅菌后，切成0.5-1cm的小段，其中結節(jié)的部位位于末端傷口處；將切斷后的莖端放置于愈傷誘導培養(yǎng)基上，進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26℃；1.5個月后，待誘導出愈傷組織后，移入到愈傷增殖培養(yǎng)基中，并在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8個月，產生淡黃色的胚性愈傷組織，并將其作為農桿菌侵染對象；

（2）農桿菌侵染菌液的制備：將含有目的基因的農桿菌劃線培養(yǎng)，隨后轉移至含有50mg/L卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中，并于28℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后按照1:100的體積比例將培養(yǎng)基稀釋，并將其添加到含有50 mg/L的卡那霉素和200 μM的乙酰丁香酮的YEB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD為0.6-0.8；離心后去除上清液，將所得菌液懸浮于含有200 μM的乙酰丁香酮的AMM液體培養(yǎng)基中，稀釋至OD為0.8，得到農桿菌侵染菌液；

（3）侵染：將步驟（1）中增殖出胚性愈傷組織的外植體浸入步驟（2）得到的農桿菌侵染菌液中，真空處理15分鐘后室溫放置15分鐘；取出侵染過的外植體，置于無菌臺中，用滅菌的濾紙吸干表面菌液，后轉入含有2 mg/L 2,4-D和200 μM乙酰丁香酮的NB培養(yǎng)基中，在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)4天；

（4）篩選：將步驟（3）共培養(yǎng)完畢的愈傷組織在400 mg/L的羧芐青霉素中清洗3-5遍，后在抗性愈傷擴增培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，逐漸形成胚性愈傷組織，用于不定芽的誘導；所述篩選培養(yǎng)的條件為：26℃的黑暗條件下培養(yǎng)4個月；

（5）不定芽的誘導：將步驟（4）篩選培養(yǎng)得到的愈傷組織放置到抗性芽誘導培養(yǎng)基中進行不定芽誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，70 μmol m^-2 s^-1，光照條件下培養(yǎng)16h，黑暗下培養(yǎng)8小時；不定芽誘導培養(yǎng)后，在芽增殖培養(yǎng)基中進行不定芽伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照條件下培養(yǎng)16 h，光照強度70 μmol m^-2 s^-1；所述芽增殖培養(yǎng)基的配方與芽誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)相同；

（6）誘導生根：當再生的芽生長到3-4厘米長時，轉入到不含有抗生素的誘導生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，70 μmol m^-2 s^-1，光照條件下培養(yǎng)16h，黑暗下培養(yǎng)8小時；誘導生根后即成為完整的麻竹轉基因植株，后移栽入土；

步驟（1）中所述的愈傷誘導培養(yǎng)基的配方為：MS+2,4-D 8 mg/L + IBA 0.5 mg/L+250mg/L PVP+3g/L 山梨醇+ 30 g/L 蔗糖；

步驟（1）中所述愈傷增殖培養(yǎng)基的配方為：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4-D；

步驟（4）中所述的抗性愈傷擴增培養(yǎng)基的配方為：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4-D+35 mg/L潮霉素+400 mg/L羧芐青霉素；

步驟（5）中所述的抗性芽誘導培養(yǎng)基的配方為：35 mg/L潮霉素+200 mg/L羧芐青霉素+MS培養(yǎng)基+蔗糖 30 g/L+ TDZ 0.1mg/L+ NAA 0.5 mg/L＋250 mg/L PVP+瓊脂粉8 g/L；

步驟（6）中所述的誘導生根培養(yǎng)基的配方為：MS+IAA 1 mg/L+30 g/L 蔗糖+35 mg/L潮霉素。

2.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的麻竹轉化方法，其特征在于：步驟（2）中所述的農桿菌菌種為EHA105。