[發(fā)明專利]一種以D101大孔吸附樹脂提高谷氨酸脫羧酶活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710510280.4
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107326052B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊勝遠(yuǎn);韋錦
• 申請（專利權(quán)）人: 嶺南師范學(xué)院
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 張月光;林偉斌

本發(fā)明涉及一種以D101大孔吸附樹脂提高屎腸球菌谷氨酸脫羧酶活性的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明是以D101大孔吸附樹脂作為屎腸球菌谷氨酸脫羧酶的酶活促進(jìn)劑，按照D101大孔吸附樹脂質(zhì)量∶底物溶液體積∶屎腸球菌菌懸液或谷氨酸脫羧酶游離酶液體積為1∶1∶1的比例混合構(gòu)建D101大孔吸附樹脂?谷氨酸脫羧酶復(fù)合催化體系，當(dāng)于80 r/min、37～43℃水浴振蕩器反應(yīng)或攪拌罐中低速攪拌反應(yīng)24 h～36 h，γ?氨基丁酸的產(chǎn)量可提高18.54%～149.11%。D101大孔吸附樹脂除了顯著提高谷氨酸脫羧酶的活性外，其對γ?氨基丁酸的交換吸附作用也是γ?氨基丁酸純化的過程，簡化了下游提取純化工藝，降低生產(chǎn)成本；方法簡便，綠色環(huán)保。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以D101大孔吸附樹脂提高谷氨酸脫羧酶活性的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)是一種具有4個碳原子的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓、鎮(zhèn)靜和改善睡眠等作用，已成為備受關(guān)注的藥品和保健品成分。由于可以通過內(nèi)酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此γ-氨基丁酸還是生產(chǎn)生物塑料聚酰胺4的重要原料。

微生物生長繁殖快，以其生產(chǎn)γ-氨基丁酸不受時間和空間限制，因此通過微生物谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生產(chǎn)γ-氨基丁酸備受關(guān)注。谷氨酸脫羧酶是一種依賴于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中，是生物體催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)發(fā)生α-羧基脫羧作用生成γ-氨基丁酸的唯一酶。由于谷氨酸脫羧酶作用的底物(L-谷氨酸)和產(chǎn)物(γ-氨基丁酸)均為小分子，可以透過細(xì)胞膜，因此可以直接采用細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)γ-氨基丁酸，減少胞內(nèi)酶的提取成本，簡化生產(chǎn)工藝。已有文獻(xiàn)通過唾液鏈球菌嗜熱亞種、戊糖片球菌、屎腸球菌、短小乳桿菌、大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備γ-氨基丁酸的報道。

陸兆新、楊勝遠(yuǎn)等在中國專利(專利號ZL 200510040758.9)中公開了一種γ-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，它是以唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)為菌種，作用于谷氨酸、谷氨酸鹽、含谷氨酸或谷氨酸鹽的物質(zhì)，使谷氨酸的α-羧基發(fā)生脫羧作用，從而生成γ-氨基丁酸。

吳天祥等在中國專利(公開號CN101240301)中公開了固態(tài)發(fā)酵制備γ-氨基丁酸的方法，包括如下步驟：首先以腐乳為原料篩選出紅曲霉菌種；接著將紅曲霉MP1104菌種置于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，使菌種活化；然后發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min下將活化菌種搖床培養(yǎng)2d，制備發(fā)酵種子，優(yōu)選固態(tài)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基；最后將菌種在上一步驟中優(yōu)選的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn)γ-氨基丁酸。該方法以大米為發(fā)酵原料，以紅曲霉為菌種，具有食用安全性，可以作為保健食品直接食用；該方法的γ-氨基丁酸產(chǎn)量和純度均高，在最佳發(fā)酵條件與培養(yǎng)基下，γ-氨基丁酸產(chǎn)量由初始的0.21mg/g可達(dá)到0.35mg/g，最終產(chǎn)品的純度可以達(dá)到45％。

焦慶才等在中國專利(專利號ZL 200410064813.3)中公開一種γ-氨基丁酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，該制備方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸兩種混合酸性氨基酸作為原料，將具有高活力L-谷氨酸脫羧酶的埃希氏菌Escherichia coli AS1.505的菌體細(xì)胞與含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的轉(zhuǎn)化液混合，28-45℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。該方法解決了兩種酸性混合氨基酸高效分離的難題，得到了附加值較高的γ-氨基丁酸，并具有原料價格低廉，操作簡便，轉(zhuǎn)化時間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。