[發(fā)明專利]生產(R,R)-2,3-丁二醇基因工程菌株的構建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710509047.4
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107201375B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設計）人: 陳先銳;黃日波;謝能中;黃艷燕;韋航;李檢秀;王青艷;李曉明
• 申請（專利權）人: 南寧邦爾克生物技術有限責任公司;廣西科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N1/21;C12P7/18
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

1.一種生產(R,R)-2,3-丁二醇基因工程菌株的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）將α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因的核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化；（2）將經密碼子優(yōu)化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因拼接獲得包含該三個基因的基因簇，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（3）將基因簇插入表達載體中，獲得多順反子重組質粒；（4）將多順反子重組質粒導入宿主菌E. coli，獲得生產(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌株；

所述宿主菌E. coli為多基因缺失的突變菌株，通過疊加敲除菌株中合成副產物的關鍵基因而獲得；所述副產物包括meso-2,3-丁二醇、丁二酸、甲酸、乙醇和乙酸；所述合成副產物的關鍵基因包括dar、frdABCD、pflB、adhE和pta。

2.如權利要求1所述的構建方法得到的基因工程菌株在生產(R,R)-2,3-丁二醇的應用，其特征在于：包括以下步驟：

發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化鈣，在80-100℃下液化0.5-5 h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃以下時，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20 h，調節(jié)pH 6.5-7.5，離心或過濾收集上清，稀釋上清液后在115℃條件下滅菌15 min，即得；按1000 mL水計，所述液化和糖化的各組分用量為：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2 mL，氯化鈣0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05~0.5 g；所述木薯粉是將木薯去皮曬干后經粉碎過50-200目篩制備而得，所述氮源原料為棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉、花生蛋白粉中的一種或兩種以上組合；

在無菌條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-100 μg/mL氨芐青霉素，然后移至發(fā)酵罐中，將經活化的基因工程菌菌液以體積比為1-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度35-42℃、攪拌轉速200-800 rpm、通氣量0.2-1.0 vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)20-72 h，當檢測發(fā)酵液中(R,R)-2,3-丁二醇的濃度不再增加時，發(fā)酵結束。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述基因工程菌菌液的制備方法包括以下步驟：（1）將生產(R,R)-2,3-丁二醇基因工程菌株劃線到含有質量體積比為1.8%瓊脂和含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)10-15 h；在無菌的條件下，挑取LB平板上的一個單菌落，然后接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)10-15 h；所述LB培養(yǎng)基的配方為：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于：在發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液中葡萄糖的濃度，當葡萄糖濃度降至10-30 g/L時，補加木薯還原糖母液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度為40-80 g/L；所述木薯還原糖母液的葡萄糖濃度為500-800 g/L。