[發明專利]線粒體耳聾A7445G突變的熒光定量PCR檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710507764.3
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107267614A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 舒強;尚世強;李偉;陶然
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 趙杭麗

技術領域

本發明屬分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及線粒體耳聾A7445G突變的熒光定量PCR檢測試劑盒及其應用。

背景技術

耳聾是全球關注的公共衛生問題，由遺傳和環境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體DNA(mtDNA)突變是母系遺傳性耳聾發生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發病率約為1％～2％。

耳聾相關的mtDNA tRNA基因突變共涉及16種tRNA，其中tRNA^Ser(UCN)基因是耳聾相關突變的熱點區域。A7445G突變位于tRNA^Ser(UCN)前體3’端核酸外切酶的作用位點附近，突變發生時可影響核酸外切酶的識別，導致tRNA^Ser(UCN)前體加工缺陷，進而影響tRNA^Ser(UCN)結構的穩定和線粒體自身蛋白的翻譯，使細胞氧化磷酸化過程受損。同時，由于該突變處在tRNA^Ser(UCN)/CO1的基因連接處，可引起CO1多肽mRNA終止密碼子的改變，并通過在CO1多肽的C末端增加3個氨基酸殘基(絲氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸)改變了CO1多肽原有的形態，影響了細胞色素C氧化酶的空間結構和生理功能，阻礙了呼吸鏈上的電子傳遞過程，最終導致耳聾的發生。

目前，mtDNA突變的常見檢測方法主要有直接測序法、微陣列芯片法、PCR-RFLP法、熒光定量PCR法等。直接測序法的優點是準確性高，但檢測周期較長，且需要專業的測序儀和結果判讀人員，不適合臨床推廣應用。微陣列芯片法具有高通量的優點，但存在檢測成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點，不適用于大樣本篩查的需求。PCR-RFLP法由于在PCR擴增結束后需開蓋進行后續的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量PCR技術近年來在分子生物學領域的應用越來越廣泛，其基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q)；探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現對PCR過程中產物量的實時監測，除具有定量準確、檢測快速等優點外，最大的優勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進一步發展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(FAM、HEX、ROX等)及多通道熒光定量PCR儀，可以實現基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。

針對熒光定量PCR傳統Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國ABI公司于2000年推出一種新的Taqman探針——MGB探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團，在吸收報告基團的能量后并不發光，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探針的3’端還連接了一個二氫環化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩定性，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值。而短探針的主要優點在于熒光報告基團與淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時，短探針也簡化了設計和降低了成本。有實驗表明MGB探針對于等位基因的區分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變。

發明內容

本發明提供一種線粒體耳聾常見突變A7445G的熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應液、第一陽性對照品、第二陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-CACCCTACCACACATTCGAAGA-3’

下游擴增引物序列為：5’-TGGCTTGAAACCAGCTTTGG-3’

第一熒光探針序列為：5’-FAM-CCGTATACATAAAATCTAGGCA-MGB-3’

第二熒光探針序列為：5’-HEX-CCGTATACATAAAATCTAGACAA-MGB-3’

第一陽性對照品為線粒體第7445位點為A堿基的DNA樣品，第二陽性對照品為線粒體第7445位點為G堿基的DNA樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發明試劑盒應保存于-20℃，盡量減少反復凍融。