[發明專利]在水稻基因打靶中識別特異位點的PL?LbCpf1?RVR基因及其應用

在審

• 申請號: 201710505886.9
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107099544A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 秦瑞英;楊劍波;許蓉芳;李浩;李莉;魏鵬程;李娟
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種在水稻基因打靶中識別特異位點的PL-LbCpf1-RVR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RVR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的一種RVR在水稻基因打靶中能夠實現打靶的PL-LbCpf1-RVR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RVR基因包含序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的變體。

3.一種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含權利要求1所述的PL-LbCpf1-RVR基因。

4.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包含權利要求1所述的PL-LbCpf1-RVR基因或權利要求3所述的表達盒。

5.一種權利要求1所述的基因、權利要求3所述的表達盒或權利要求4所述的載體的應用，其特征在于，所述應用包括利用所述PL-LbCpf1-RVR基因實現對水稻基因組的剪切，獲得含有突變位點的轉基因植物或植物部分。

6.一種利用含有權利要求1中所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表達載體構建特異基因打靶載體，將打靶載體導入水稻細胞的方法，包括下述步驟：

(1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；

(2)將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養，獲得愈傷組織；

(3)將步驟(2)中獲得的愈傷組織與農桿菌接觸15分鐘，其中，所述農桿菌中引入了所述打靶載體，所述打靶載體中攜帶所述RVR在水稻基因打靶中識別特異位點的PL-LbCpf1-RVR基因；

(4)將步驟(3)處理后的愈傷組織轉移到其上墊有無菌濾紙的培養皿中，21-23℃培養48小時；

(5)將步驟(4)處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天；

(6)將步驟(5)處理后的愈傷組織轉移篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織；

(7)將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和

(8)將步驟(7)中所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。

7.根據權利要求6所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表達載體構建特異基因打靶載體，將打靶載體導入水稻細胞的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。

8.根據權利要求6所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表達載體構建特異基因打靶載體，將打靶載體導入水稻細胞的方法，其特征在于，所述方法還包括對所獲得水稻樣品進行分子鑒定。

9.根據權利要求8所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表達載體構建特異基因打靶載體，將打靶載體導入水稻細胞的方法，其特征在于，所述分子鑒定采用的PCR引物為5’-TTCACAACCGCGTTTACC-3’及5’-TCACCACCGCCTTCTTCT-3’。