[發明專利]一種應答3-脫氫莽草酸的生物傳感器及其應用

有效

• 申請號: 201710503939.3
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107974451B
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 王欽宏;涂然;李梁坡;李林;陳五九
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N1/21
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙) 12219
• 代理人: 張勇

利用基因工程或代謝工程等手段構建生產3?脫氫莽草酸(3?dehydroshikimate,DHS)的菌株已獲得成功，但快速獲得高效穩產的菌株成為利用生物手段規模化生產3?脫氫莽草酸的最大瓶頸。本發明用調控基因cusR和/或調控基因cusR的啟動子以及報告基因組成生物傳感器，實現對3?脫氫莽草酸濃度正相關應答，解決了3?脫氫莽草酸化合物本身無色，且缺少有效的顯色反應從而難以實現高通量篩選的技術瓶頸，進一步的開發出一種產3?脫氫莽草酸菌株突變庫篩選方法。

技術領域

本發明涉及生物傳感器及生物技術領域，尤其涉及新型3-脫氫莽草酸應答功能生物傳感器、包含該生物傳感器的轉錄表達系統以及包含該生物傳感器的高通量篩選系統。

背景技術

3-脫氫莽草酸(3-dehydroshikimate,DHS)是植物和微生物生存所必需的中間代謝產物，經進一步加工可形成高附加值產品，是一種重要的藥物及精細化學品原料。傳統采用化學方法進行合成，由于其合成原料用到苯或甲苯，往往對人體和環境造成危害。近年來，利用基因工程或代謝工程等手段生產3-脫氫莽草酸獲得成功，但快速獲得高效穩產的菌株成為利用生物手段規模化生產3-脫氫莽草酸的最大瓶頸，其原因在于：3-脫氫莽草酸化合物本身無色，且缺少有效的顯色反應，目前，篩選3-脫氫莽草酸高效穩產細胞主要基于HPLC或質譜，檢測速度慢，檢測量每天僅數千個候選菌。因此，尋找高通量細胞篩選方法成為利用高效菌株規模劃化生產3-脫氫莽草酸的重要途徑。

近年來，采用能夠應答小分子代謝物的生物傳感器，并結合報告基因構建生物傳感器，實現小分子代謝物含量及其表達細胞的快速檢測已經獲得巨大成功。已有通過代謝物小分子應答基因構建生物傳感器用于相應工程菌株篩選以及通過代謝物小分子應答基因可控表達目的基因的案例，包括相應生物傳感器應用于纈氨酸、亮氨酸、苯甲酸酯等多種小分子菌株突變庫篩選工作，但是，目前還沒有正相關應答3-脫氫莽草酸基因的報道。

Munson和Gudipart等分別研究證實：調控基因cusR為胞質內銅離子感應調控因子，其與編碼膜結合感應組氨酸激酶的基因cusS共同組成cusSR雙元件系統，該cusSR雙元件系統將調控激活位于該雙元件系統相反方向操縱子cusCFBA的表達，該操縱子的基因cusB和cusA預測編碼跨膜蛋白，cusA編碼的膜蛋白形成雙通道泵的結構用以排除胞內過多的銅離子，而基因cusC預測為膜外蛋白，起到感應銅離子濃度作用。綜上，操縱子cusCFBA的作用在于排除胞內銅離子，使細胞免受過高銅離子帶來的危害。但已公開的信息中從未報道cusR與3-脫氫莽草酸的一定正相關應答特性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種應答3-脫氫莽草酸的生物傳感器，并利用該生物傳感器構建應答3-脫氫莽草酸濃度生物傳感器，進而構建一種高產3-脫氫莽草酸細胞的篩選方法。

一種應答3-脫氫莽草酸的生物傳感器，所述生物傳感器包括調控基因cusR和/或調控基因cusR的啟動子組成的傳感器核心元件。

本發明中調控基因cusR的核苷酸序列為下述的任意一種：

1)SEQ IDNO：1所示的多核苷酸；

2)SEQ IDNO：1所示序列的同源性≥80％，(較佳的≥95％)，且其表達強度表現出與3-脫氫莽草酸濃度應答正相關性。

3)與1)-2)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。

本發明中調控基因cusR的啟動子的核苷酸序列為下述的任意一種：

1)SEQ IDNO：2所示的多核苷酸；

2)SEQ IDNO：2所示序列的同源性≥80％，(較佳的≥95％)，且其能控制cusR基因轉錄。

3)與1)-2)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。

本發明中所述的生物傳感器用于構建應答3-脫氫莽草酸的生物傳感器；