[發明專利]基于16SrRNA鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法和專用引物

有效

• 申請號: 201710503231.8
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107345250B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 樊艷鳳;高玉時;唐修君;葛慶聯;顧榮;賈曉旭;劉茵茵;馬麗娜;張靜;黃勝海;王玨
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許春光;沈志海

1.基于16S rRNA鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定專用引物對，其特征是，所述引物對的核苷酸序列為：

所述引物對的上游引物序列為：5' AAGGATACCACAATTTAAC 3'，

所述引物對的下游引物序列為：5' AGAGGGAAGGTAGTGTT 3'；

利用引物進行鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法有兩種方法：

方法一、利用引物進行鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法為：分別提取鵪鶉肉樣本DNA作為陽性對照樣本和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃度；利用所述PCR擴增鑒定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA在相同條件下進行PCR擴增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，以鵪鶉肉樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜中118bp電泳條帶為陽性結果；將待測肉樣DNAPCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與陽性結果進行比對，如果待測肉樣DNA PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現電泳條帶118bp并與陽性對照樣本條帶亮度相同，認定待測鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉；此時， PCR擴增反應體系為：2×PCR Mix10 μl，10mol/μl上游引物 0.2μl，10mol/μl下游引物 0.2μl，模板DNA 1μl，滅菌雙蒸水8.6μl；PCR擴增的反應程序為95℃ 5 min； 95℃ 30 s，60℃ 30 s， 72℃ 30 s此過程經過32個循環，最后72℃ 延伸5 min；PCR擴增產物為：

5’ AAGGATACCA CAATTTAACC CCCTTATGTA AAGATTAAGA ACAATTCGAC GGAGGTACAG 3’

5’ CTCCATCGAA AAAGAATACA ACCTCCCCCA GCGGATAAAC TAACACTACC TTCCCTCT 3’；

方法二、利用引物進行鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法為：提取鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃度；利用所述PCR擴增鑒定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA在相同條件下實時熒光定量PCR擴增，對PCR擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，確定擴增產物的Tm值熔解曲線圖譜；以鵪鶉肉樣本DNA擴增曲線的Ct值小于34的擴增曲線作為陽性結果，將待測肉樣DNA的擴增曲線圖譜與陽性結果對照，如果待測鵪鶉肉DNA的擴增產物的 Ct值小于34，認定待測鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉；此時，實時熒光定量PCR擴增反應體系為20 ng /μl DNA模板 1.0μl，10 pmol/μl上游引物 0.2μl，10pmol/μl下游引物 0.2μl，SYBR RealMaster Mix 7.5μl，雙蒸水6.1μl；所述實時熒光定量PCR擴增反應程序為：50℃預熱2min，95℃預變性10min，然后95℃變性15s、60℃退火延伸1min，共40個循環，最后95℃變性15s，60℃退火延伸30s，95℃變性15s收集熔解曲線；所述實時熒光定量PCR擴增反應在ABI 7500序列擴增儀中進行。