[發明專利]腹瀉病原體多重基因檢測體系及其試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201710503230.3
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107245531B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 張艷梅;趙虎;保志軍;李敏;楊長青;陳敏;楊麗華;李冬;吳勇;陳潔;戴兆云;王詩雯;楊峰;張景皓;趙付菊;方毅
• 申請（專利權）人: 華東醫院;寧波海爾施基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

本發明涉及一種腹瀉病原體多重基因檢測體系及其試劑盒和應用。檢測體系共有22對引物，其中包括19對腹瀉病原體、2對人基因組內參和1對系統質控內參引物。腹瀉病原體分別針對空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產毒性大腸埃希菌、大腸埃希菌O157、弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒II、人腸道腺病毒、輪狀病毒等。本發明的腹瀉病原體多重檢測體系及其試劑盒不需要采用常規培養等步驟，可在同一反應體系內直接對糞便樣本進行多種腹瀉病原體的同步檢測和分析，彌補了常規檢測方法通量低、耗時長和檢出率低等缺點，第一時間為臨床提供全面、精準、低成本的病原學診斷，為個體化用藥和精準醫療提供重要參考。

技術領域

本發明涉及一種多重基因檢測產品以及該產品所用到的檢測體系，屬于生物技術領域。

背景技術

感染性腹瀉是由多種病原體引起的腸道傳染病，是全世界范圍內最高發的消化系統感染性疾病之一。全球每年患腹瀉病達20億人次左右，我國每年發病約8億人次。感染性腹瀉已經成為僅次于呼吸道感染、影響人類健康的第二大感染性疾病。

病原學診斷對感染性腹瀉的防治具有重要意義。《世界胃腸病學組織全球指南—成人和兒童急性腹瀉：全球觀點(2012)》和《中國成人急性感染性腹瀉診療專家共識(2013)》明確指出：“感染性腹瀉的診斷包括臨床診斷和病原學診斷，后者不僅為合理治療提供依據，同時為流行病學調查以及預防和控制腹瀉病的傳播和流行提供重要線索”。目前，由于引起腹瀉的病原體種類繁多，高達數十種，而常規的檢測方法局限性大，難以實現精準的病原學診斷，導致臨床治療盲目、耐藥菌產生，使得感染性腹瀉未能得到最及時和有效地控制。

但是,感染性腹瀉病原體的常規檢測方法、檢測流程、臨床治療方案都具有局限性。

目前國內外檢測腹瀉相關病原體的常規方法包括：①細菌培養法：通過分離、培養和鑒定腸道致病菌，結合血清學分型方法，確定腸道致病菌種屬和血清型。該方法特異性強，可以直接為臨床提供明確的病原學診斷和體外藥敏試驗結果。但是引起感染性腹瀉的病原體種類繁多，不同種屬的腸道致病菌的培養方法和培養條件各不相同，該方法無法同時采用所有的腸道致病菌都適合的分離培養方法(比如培養基的類型和培養環境)，造成了病原菌陽性檢出率低，假陰性率高，導致臨床漏診和誤診率高。同時該方法耗時長，成本高。②免疫學方法：通過直接檢測糞便中病原體的特異性抗原或者血液中的特異性抗體進行病原學診斷。該方法耗時短，但敏感性和特異性低，尤其是血液中特異性抗體的產生有一個窗口期(從感染到產生可以檢測到的抗體成分)，導致該方法假陰性率高。同時該方法也無法同時檢測和鑒別數十種感染性腹瀉相關的抗原或抗體。③特異性核苷酸檢測法：通過特異性檢測感染性腹瀉相關病原體的基因片段進行診斷。其優點是特異性和敏感性高，但缺點是無法同時檢測和鑒定感染性腹瀉相關的多種病原體，而且成本高。

感染性腹瀉病原體常規檢測流程和步驟為：①首先采集腹瀉患者糞便樣本進行腸道致病菌的培養——直接接種SS平板，分離培養沙門菌/志賀菌；同時接種堿性蛋白胨水增菌后轉種TCBS平板，分離培養弧菌。②常規培養陽性者，進行生化鑒定、血清學鑒定和體外藥敏試驗。常規培養陰性者，如果臨床癥狀符合腸道細菌感染癥狀，需再次采集糞便樣本進行致病性大腸埃希菌、小腸結腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌或艱難梭菌的分離培養——分別接種麥康凱平板、空腸彎曲菌平板和CCFA平板，陽性者進一步進行生化鑒定、血清學鑒定和體外藥敏試驗。③以上細菌培養陰性或者其它實驗室檢查指標符合病毒性腹瀉的患者，需要進行腸道病毒的免疫學或特異性核酸檢測。臨床上感染性腹瀉病原體的檢測流程步驟多、費用高、時間長。全面檢測費用至少需要1000元，耗時可長達72小時。

不同的病原體引起的感染性腹瀉的治療和隔離的方法各不相同。