[發(fā)明專利]一種小反芻獸疫病毒HN蛋白抗原表位肽及其確定、制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710501704.0
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107033225A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁忠祥;竇永喜;朱學亮;蒙學蓮;張志東;才學鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K14/12
• 分類號: C07K14/12;A61K39/165;A61P31/14;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11279
• 代理人: 席勇

1.一種小反芻獸疫病毒HN蛋白抗原表位肽，其特征在于：所述抗原表位肽的氨基酸序列為：

H123：¹²³KFLNPDREYDFRDLR¹³⁷；

或/和H185：¹⁸⁵GTGCLGRTVTRA¹⁹⁶；

或/和H487：⁴⁸⁷IRGPRGRCH⁴⁹⁵；

或/和H569：⁵⁶⁹ECFPWYHKVWCYHDCLI⁵⁸⁵。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小反芻獸疫病毒HN蛋白抗原表位肽在小反芻獸疫病毒表位疫苗抗原和診斷試劑抗原制備中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小反芻獸疫病毒HN蛋白抗原表位的確定、制備方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

計算模擬：

步驟一，用分子模擬軟件構(gòu)建虛擬HN蛋白頭部3D結(jié)構(gòu)：利用Discovery Studio V4.5對這兩個目標蛋白——野毒株P(guān)PRV HN和疫苗株P(guān)PRV HN蛋白進行同源模建；其中PPRV Hw，GenBank登錄號為FJ905304；PPRV Hv，GenBank登錄號：X74443；

步驟二，搜索模板：搜索PDB數(shù)據(jù)庫(www.pdb.org)，尋找通過實驗解析出的同源蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇序列一致性在30％以上，并且比對序列較長的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)，進行后續(xù)的計算；

步驟三，調(diào)整序列比對：選取模板蛋白之后，從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白的空間坐標，將得到的模板蛋白序列與目標蛋白進行比對；

步驟四，建模：將比對結(jié)果提交服務(wù)器，根據(jù)模板蛋白的空間坐標和序列的相似性推測結(jié)構(gòu)，從而計算得到目標蛋白結(jié)構(gòu)，即每次模建生成至少5個不同的目標蛋白結(jié)構(gòu)，要求PDF Total Energy較低的同時選擇DOPE Score最低的模型進行后續(xù)計算；

步驟五，優(yōu)化：采用CHARMm力場，先進行Steepest Decent優(yōu)化5000步，再進行Conjugate Gradient優(yōu)化2000步；

步驟六，評估結(jié)構(gòu)：采用拉氏構(gòu)象圖分析方法評估蛋白結(jié)構(gòu)的合理性，若位于不許可區(qū)的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超過5％，則說明模擬的蛋白結(jié)構(gòu)是合理的，可以進行后續(xù)的計算分析；

基于免疫信息學的預測：

步驟一，PPRV-HN蛋白B細胞抗原表位預測：將PPRV HN蛋白的氨基酸序列用IEDB、Immunomedicine Group和BepiPred免疫信息學分析軟件進行分析，綜合分析預測其B細胞抗原表位；

步驟二，抗原表位的合成：將軟件預測的抗原表位氨基酸序列送GeneScript公司用多肽合成儀合成，合成后用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析多肽合成的純度及氨基酸的正確性；

抗體的制備；

步驟一，免疫動物：具有反應(yīng)原性目的抗原rPPRV-HN-F和小反芻獸疫病毒糖蛋白(PPRV-Glycoprotein)免疫6-8周齡雌性Balb/c小鼠，頸背部皮下四點注射，免疫蛋白樣品量為50μg/只，免疫體積200μL/只；首次免疫用等體積弗氏完全佐劑乳化，二次免疫和三次免疫用等體積弗氏不完全佐劑乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠斷尾采血檢測血清中的抗體，待抗體效價高1：10000后方可進行四免，四免不用佐劑，腹腔注射；

步驟二，多克隆抗體的純化，將乙醚完全浸潤的脫脂棉和小鼠同時放入麻醉盒，待小鼠完全失去知覺時，摘取眼球取學，收集完成后，將小鼠斷頸處死，全血放37℃孵育30分鐘后4℃過夜，4℃，1500rpm，離心15分鐘，取血清，-20℃?zhèn)溆茫?/p>

表位的鑒定：

預測的表位經(jīng)過生物合成，鑒定符合實驗要求，使用氨基化酶標板作為固相載體的間接ELISA方法進行；

稀釋：將合成并凍干的表位肽用高壓過的去離子水稀釋成1μg/μL；

表位肽包被：將稀釋好的表位肽包被在氨基化酶標板上，每孔50μL包被液，抗原的含量為5μg，4℃過夜；

洗板：將酶標孔里的液體盡可能甩盡，然后每孔加入約250μLPBST，靜置3分鐘，重復三次，最后將酶標板在紗布上拍干；

封閉：向酶標孔中加入1×封閉液150μL，37℃溫箱孵育1.5小時后，將酶標孔里的封閉液盡可能甩盡，最后將酶標板在紗布上拍干后備用；

孵育一抗：用封閉液將單克隆抗體按1:500稀釋，加入酶標板每孔50μL，放置37℃溫箱中孵育1小時；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封閉液將HRP標記抗鼠IgG二抗按1:5 000稀釋，加入酶標板每孔50μL，放置37℃溫箱中孵育1小時；

洗板：同上步洗板；

顯色：每孔加入50μL TMB顯色液，避光37℃孵育15分鐘；

終止：每孔加入50μL終止液，終止顯色；

讀取：用終點法在波長450nm處對酶標板進行檢測，讀取OD450nm吸光度值；多表位抗原設(shè)計：

步驟一：設(shè)計多表位基因及誘導表達，將表位按照在天然蛋白中的順序排列，表位之間加GS接頭分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，連接到pET30a載體中；將載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，按照培養(yǎng)溫度37℃，誘導劑IPTG終濃度為1.0mM，氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，誘導7小時進行誘導表達；

步驟二：多表位抗原的純化

破碎菌體：將菌體反復凍融3次，用PBS緩沖液重懸菌體超聲破碎；

離心：將破碎的菌體4℃10 000rpm離心20分鐘，分別收集沉淀和上清；

樣品準備：使用pH＝7.4緩沖液I重懸上步收集的沉淀，充分混勻，8 000rpm，4℃離心20分鐘，取上清用0.45μm濾器過濾處理待上樣；

平衡Ni柱：先在柱子底部加入少量去離子水排除空氣，再裝入2mL Ni-NAT填料，將裝好的柱子用5倍體積的去離子水洗滌以去除乙醇，最后用5倍體積的pH＝7.4緩沖液I平衡柱材；

上樣：將濾器過濾處理后的樣品，分次與柱材結(jié)合，靜置，待自然沉降，收集流湍液4℃環(huán)境保存；

洗滌：分次向柱子中加入pH＝7.4緩沖液I，總體積應(yīng)大于上樣量的5倍體積；洗脫：使用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和400mM咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫蛋白，每個洗脫濃度靜置15分鐘，收集各濃度洗脫液置于冰上；

柱子保存：洗脫步驟完成后，用5倍柱材體積的pH＝7.4緩沖液I清洗柱子，加入適量20％乙醇4℃保存；

步驟三：多表位抗原的鑒定

蛋白電泳樣品準備：取40μL蛋白上述步驟中分離的蛋白樣品于1.5mL離心管中，再加入10μL 5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10分鐘，置于4℃冰箱快速降溫；上樣及電泳：取10μL于12％SDS-PAGE中，100mV電泳；

轉(zhuǎn)膜：將NC膜剪至與凝膠等量大小，并置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，按照從負極到正極的順序分別放置厚濾紙、凝膠、NC膜、厚濾紙，注意應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，200mA恒流濕轉(zhuǎn)100分鐘；

封閉：取出轉(zhuǎn)印后的NC膜，置于適量5％脫脂奶粉中，室溫封閉兩小時；

加一抗：將封閉完成的NC膜置于5％的BSA中，加入鼠抗His單克隆抗體按1:2500比例稀釋和羊源小反芻獸疫陽性血清按1:250比例稀釋，4℃冰箱過夜孵育；洗滌：一抗孵育完成后，用PBST搖動洗滌3次，每次10分鐘；

加二抗：將NC膜置于兔抗鼠IgG-HRP按1:5 000比例稀釋和驢抗羊IgG-HRP按1:25 000比例稀釋二抗中，稀釋液為含有5％脫脂奶粉的PBST，室溫搖動孵育1小時；

洗滌：同上步洗滌；

顯色：將洗滌完成的NC膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，混合ECL超敏發(fā)光液A和B，滴在NC膜上室溫孵育3分鐘；

觀察：調(diào)節(jié)不同的曝光時間，直到清洗看到明顯的條帶；

步驟四：免疫小鼠，將小白鼠分為5組，A組：PBS+弗氏不完全佐劑，B組：疫苗，C組：EHF1+弗氏不完全佐劑，D組：EHF2+弗氏不完全佐劑，E組：EHF3+弗氏不完全佐劑，每組12只小鼠，每只免疫蛋白50μL，免疫體積每只200μL，頸背部分四點皮下注射，21天后再次免疫；

步驟五：小鼠特異性抗體檢測，0天、7天、14天、28天和35天斷尾采血，37℃孵育30分鐘，4℃過夜，3000rpm離心15分鐘收集血清，儲存于-80℃?zhèn)溆茫冒籔PRV全病毒的間接酶聯(lián)免疫法檢測抗體水平；

步驟六：小鼠T淋巴細胞水平檢測，檢測免疫小鼠CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞的增值情況，采用流式細胞技術(shù)檢測免疫后0天，14天和26天外周血T細胞，在第35天檢測脾臟中的T淋巴細胞，步驟如下：

采血：斷尾采取小鼠抗凝血，每組采集5只小鼠，每只100μL；

抗體孵育：將采集的每只100μL抗凝血平均分成兩份，其中一份加入APC Hamster Anti-Mouse CD3e抗體和PE Rat Anti-Mouse CD4抗體各2.5μL，F(xiàn)ITC Rat Anti-Mouse CD8a抗體1μL；另一份加入APC Hamster IgG1,κIsotype Control抗體、PE Rat IgG2a,κIsotype Control抗體和FITC Rat IgG2a,κIsotype Control抗體各2.5μL，混勻后，避光4℃孵育15分鐘；

裂解紅細胞：加入1mL1×紅細胞裂解液，混勻，避光室溫孵育10分鐘；

洗滌：加入1mL Hank’S液,混勻，1 000g離心5分鐘，重復2次；

過濾：上樣前用高壓后的300目尼龍網(wǎng)過濾；

上樣：將準備好的樣品放在流式細胞儀上樣架上，準備收集細胞。