[發(fā)明專利]一種可視化抗菌肽融合蛋白及其制備方法和其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN109134662B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚斌;黃火清;華婷;羅會(huì)穎;王苑;柏映國;孟昆;涂濤;王亞茹;蘇小運(yùn)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 北京法信智言知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 劉靜榮

本發(fā)明主要提供了一種在酵母中高效表達(dá)抗菌肽的方法。本發(fā)明所提供的方法包括將抗菌肽與一種紅色熒光蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，在重組酵母中可以通過肉眼可見的顏色深淺判斷菌株中抗菌肽產(chǎn)量的高低，以此快速篩選出高表達(dá)抗菌肽并具強(qiáng)抑菌活性的工程菌株。本發(fā)明還提供了一種具抑菌活性的重組融合蛋白和工程重組菌，所述重組蛋白和重組菌可直接應(yīng)用于工業(yè)或飼料行業(yè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基團(tuán)工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種可視化抗菌肽融合蛋白及其制備方法和其應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗菌肽(antibacterial peptides)是一般由12～50個(gè)氨基酸殘基組成的陽離子型(含過多的賴氨酸和精氨酸)的兩性小分子多肽。在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，其抗菌譜寬、免疫原性低，而且不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)及有抑制癌細(xì)胞生長的作用，這使得抗菌肽開發(fā)利用成為近年來的研究熱點(diǎn)。但抗菌肽的開發(fā)利用并非易事，抗菌肽天然資源有限，提取非常復(fù)雜；化學(xué)合成，不但成本很高，還對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此迫切需要一種廉價(jià)安全的生產(chǎn)技術(shù)來生產(chǎn)抗菌肽。基因工程生產(chǎn)方法可能是最經(jīng)濟(jì)的獲得大量抗菌肽的方法。

目前抗菌肽基因工程表達(dá)主要在大腸桿菌和酵母菌系統(tǒng)中進(jìn)行。酵母菌表達(dá)體系具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接從發(fā)酵液中分離抗菌肽，相比大腸桿菌表達(dá)體系更易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。但是，由于抗菌肽是小分子含有多個(gè)堿性氨基酸的堿性多肽，極易受到蛋白酶的攻擊。同時(shí)表達(dá)的產(chǎn)物往往對宿主細(xì)胞有毒性，會(huì)直接抑制宿主菌的生長，影響表達(dá)效率。因此抗菌肽的外源表達(dá)較其它多肽類藥物更為困難。另外，篩選抗菌肽的高效表達(dá)工程菌時(shí)，通常采用抗菌肽有特殊的抗菌活性，通過抑菌實(shí)驗(yàn)篩選，那么每次就要對成千上萬的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，先對每個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選，利用抗菌篩選抗菌活性相對較高的工程菌，再來進(jìn)行復(fù)篩，這樣要消耗大量的人力和物力。因此，如何解決抗菌肽免受蛋白酶的攻擊，減少其對宿主細(xì)胞的毒害，以及如何篩選高效表達(dá)抗菌肽的酵母工程菌成為了抗菌肽事業(yè)發(fā)展的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種重組融合蛋白His-mApple-DP-AP，所述蛋白包括如下1)或2)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID №.7所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中的SEQ ID №.7的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有抗菌肽活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

序列表中SEQ ID №.7所示的氨基酸序列由262個(gè)氨基酸殘基組成。

上述1)或2)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行重組異源表達(dá)得到。上述1)或2)所述的蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID №.7所示DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)編碼氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變后得到。

編碼所述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本發(fā)明還提供了一種編碼基因，所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一：

1)編碼本發(fā)明所述蛋白的多核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；

5)序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；

6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №：6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；