[發(fā)明專利]發(fā)生上皮間質化的循環(huán)腫瘤干細胞在肺癌增殖、耐藥及轉移疾病中的應用

在審

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• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107299084A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設計）人: 肖建如;韓帥;王霆;楊興海;周旺;吳志鵬;姜東杰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/095;A01K67/027;A61K45/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海卓陽知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)31262
• 代理人: 周春洪

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地說，是發(fā)生上皮間質化的循環(huán)腫瘤干細胞在肺癌增殖、耐藥及轉移疾病中的應用。

背景技術

近5年中因惡性腫瘤造成的死亡在全球死亡疾病譜中一直居于首位，而因惡性腫瘤死亡的患者中又以肺癌患者人數(shù)居多。根據(jù)病理類型可將肺癌分為兩大類，分別是小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。眾所周知，癌癥患者往往死于癌癥轉移所造成的并發(fā)癥，而不是原發(fā)腫瘤本身。既往臨床資料表明，不止中晚期的肺癌患者會出現(xiàn)轉移，即使是接受過根治性治療的早期肺癌患者，仍會有很高的概率出現(xiàn)復發(fā)和轉移。

癌癥的轉移是一個包含了很多關鍵事件復雜過程：理論上腫瘤細胞需要首先從原發(fā)病灶中分離，突破基底膜結構，然后通過自身發(fā)生變形遷移進入血液循環(huán)；或者由于其他原因直接進入血管或淋巴系統(tǒng)，之后還需要在血液中成功存活并停留在靶器官處，重新進行自我復制并最終形成臨床可見的遠處轉移病灶。隨著實時定量聚合酶鏈式反應(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)、流式細胞術、密度梯度離心、免疫磁珠分選等技術的出現(xiàn)，人們在大多數(shù)癌癥患者的外周血中檢測出了腫瘤細胞，并把這種存在于血液循環(huán)中的腫瘤細胞被稱為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)。CTCs的發(fā)現(xiàn)部分驗證了關于腫瘤轉移機制的“種子與土壤”的假說，并促使我們從一個新的視角對腫瘤轉移這個概念進行思考，循環(huán)腫瘤細胞是聯(lián)系腫瘤原發(fā)灶和轉移灶之間的橋梁，通過對腫瘤循環(huán)腫瘤細胞進行研究，可以對腫瘤轉移的生物學機制獲得更好的認識。

研究者認為，即使不是全部，腫瘤原發(fā)灶也是CTCs的重要來源之一，據(jù)估算，癌癥患者體內大約存在有8000～120000個循環(huán)腫瘤細胞。患者外周血中CTCs數(shù)量越多，患者生存時間越短。但這些CTCs的性狀之間存在著較大的差異，有的是單個細胞，有的是細胞團，有的與血細胞之間關系密切，還有一部分是沒有活力的死細胞。考慮到CTCs數(shù)量與臨床轉移灶之間的巨大差距，有理由推測，真正能成功定植在靶器官并最終成為新的轉移灶的CTCs應該只是這些細胞中某種亞型。因此腫瘤干細胞的學說近來逐漸引起研究者們的重視，該理論認為，不是所有的腫瘤細胞都有形成腫瘤的能力，腫瘤組織的不斷增長是由于腫瘤干細胞自我復制和分化的結果。目前，這一猜測已在動物模型上得到了部分驗證，實驗結果表明，大部分CTCs在進入循環(huán)系統(tǒng)不久之后便已死亡，只有約0.01％-2.5％的CTCs可以形成轉移灶。而某些表達正常干細胞標志的如CD44、CD133的乳腺癌細胞亞群則擁有與正常干細胞相似的特性，并且具有更強的成瘤能力。

臨床檢測結果表明，在非小細胞肺癌患者外周血中的一部分循環(huán)腫瘤細胞發(fā)生了上皮間質轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。EMT是指上皮細胞間緊密連接蛋白表達量減少，細胞微絲、骨架蛋白表達量增加；同時細胞形態(tài)由上皮細胞形態(tài)(細胞間緊密連接，有極性)向間質細胞形態(tài)(細胞便為紡錘形，變形和移動能力增強)轉變。現(xiàn)有結果表明，當腫瘤細胞發(fā)生EMT后，其侵襲轉移能力增加、凋亡減少、對常規(guī)化療藥物或靶向治療藥物的抵抗性均明顯增強。

根據(jù)上述理論和實驗結果，我們推測，這些NSCLC患者外周血中發(fā)生了EMT的循環(huán)腫瘤細胞亞群很可能是就是肺癌腫瘤干細胞所在的亞群。如果能對此種細胞進行表型和基因型特性的深入研究，可以極大的促進我們對腫瘤轉移相關機制的認識，并為新的抗癌藥物的研發(fā)提供潛在的治療靶點。但由于此類細胞數(shù)量稀少，受目前技術手段和倫理的限制，我們難以獲得足夠的樣本或對臨床患者進行長期的連續(xù)觀測。因此，我們嘗試制作一種可連續(xù)觀測腫瘤進展情況的人肺腺癌原位移植動物模型。從模型上分離發(fā)生EMT的CTCs，檢測并比較其與原始腫瘤細胞的生物學特性和基因差異，探究EMT和CTCs在肺癌轉移過程中所扮演的角色和作用。為CTCs和EMT的研究提供新的研究思路和方法，并對肺癌的診斷和治療提供一定的理論基礎和研究方向。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植腫瘤模型的建立方法。

本發(fā)明的第二個目的是，提供一種肺腺癌循環(huán)腫瘤細胞的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是，提供一種肺腺癌發(fā)生上皮間質化的循環(huán)腫瘤細胞的制備方法。

本發(fā)明的第四個目的是，提供一種發(fā)生上皮間質化的循環(huán)腫瘤細胞。