[發(fā)明專利]海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710495924.7
• 申請(qǐng)日: 2017-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN107266547A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建華;楊娜;王秀敏;滕達(dá);毛若雨;郝婭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京生泰云科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N15/12;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗菌肽及其應(yīng)用，具體地說(shuō)，涉及海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗菌肽是由生物有機(jī)體產(chǎn)生的前體經(jīng)蛋白酶降解形成的具有生物學(xué)活性的小分子多肽，主要構(gòu)成了機(jī)體防御的第一道防線(ZASLOFF，Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature，2002，415：389-395)。抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制主要是以膜作為靶位點(diǎn)，通過(guò)靜電力和受體介導(dǎo)的細(xì)胞膜作用力，引起膜通透性改變，降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，或插入細(xì)胞膜中形成跨膜的孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用機(jī)制，使其不易產(chǎn)生耐藥性，并且對(duì)許多臨床耐藥菌同樣具有殺菌作用。因此，抗菌肽被認(rèn)為可以替代傳統(tǒng)抗生素，應(yīng)用于飼料添加劑、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品防腐等領(lǐng)域。

雖然天然抗菌肽具有普遍的優(yōu)點(diǎn)，但也存在著某些明顯的不足，例如，部分抗菌肽活性相對(duì)較低，臨床應(yīng)用中對(duì)真核細(xì)胞具有強(qiáng)毒性、選擇性差，對(duì)真核生物體內(nèi)的正常菌群起到一定的殺傷作用，造成代謝的紊亂，這些都是限制抗菌肽發(fā)展的瓶頸。因此，以抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)現(xiàn)有抗菌肽進(jìn)行全新設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)改造，以期獲得高抗菌活性、低毒性的抗菌肽衍生物。

Arenicin是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物海蚯蚓體內(nèi)的一種具有β-折疊構(gòu)象的抗菌肽，它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有廣譜抗菌活性，可以抑制多種革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌，并且能夠有效抑制耐藥性大腸桿菌引起的尿路感染。但是在其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用中由于溶血性和細(xì)胞毒性而受到制約。因此，通過(guò)對(duì)抗菌肽的設(shè)計(jì)改造，保持高的抑菌活性，同時(shí)能夠顯著地降低溶血活性和細(xì)胞毒性，是本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高抗菌活性、極低細(xì)胞毒性和低溶血性的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，發(fā)明人通過(guò)對(duì)抗菌肽NZ17074分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，用丙氨酸(A)替代海蚯蚓抗菌肽NZ17074氨基酸序列中第1和12位的甘氨酸(G)，得到一個(gè)突變體抗菌肽N2。突變體N2由21個(gè)氨基酸組成，分子量為2570Da，等電點(diǎn)為9.38。該突變體保持了與母體肽相似的殺菌活性的同時(shí)，顯著降低了溶血性以及細(xì)胞毒性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供編碼所述衍生肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因、表達(dá)盒的載體。

本發(fā)明還提供含有所述衍生肽編碼基因、表達(dá)盒、載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或工程菌。

本發(fā)明還提供所述衍生肽在制備治療革蘭氏陰性菌感染的抗菌藥物或組合物中的應(yīng)用。所述革蘭氏陰性菌包括但不限于大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌。

本發(fā)明還提供所述衍生肽在制備抗內(nèi)毒素血癥藥物或組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由所述衍生肽制備的治療革蘭氏陰性菌感染的抗菌藥物或組合物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供由所述衍生肽制備的抗內(nèi)毒素血癥藥物或組合物。

本發(fā)明的抗菌肽N2對(duì)革蘭氏陰性菌具有很好的殺菌效果，并且顯著降低了對(duì)小鼠紅細(xì)胞的溶血活性以及對(duì)鼠源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。小鼠毒血癥模型試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽N2還具有抗內(nèi)毒素血癥作用，能夠顯著提高小鼠的存活率，并且優(yōu)于抗生素多黏菌素。抗菌肽N2分子量小，易于人工合成，是極具應(yīng)用價(jià)值的小分子多肽，可用于制備新型抗菌抗感染藥物等，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2對(duì)毒血癥小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。