[發明專利]一種基于微間隙陣列電極/滾環擴增技術檢測DNA損傷的電化學傳感方法

有效

• 申請號: 201710495822.5
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107287298B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 王穎;李風亭;張冰如;余超凡
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

1.一種基于微間隙陣列電極/滾環擴增技術檢測DNA損傷的電化學傳感方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）將捕獲探針（HS-P）滴加在微間隙陣列電極（MGESA）上，待修飾好后依次加入滾環模板CP和RCA反應液，RCA反應液通過DNA引物與環狀模板結合觸發，制備RCA/CP/HS-P/MGESA電極；

（1.1）將捕獲探針HS-P滴加在MGESA上，控制HS-P濃度為1×10^-6mol/L-1×10^-5mol/L，置于4℃冰箱中8-10小時，修飾后將DNA溶液吸出，洗滌幾次后，浸泡15-60min；

（1.2）向步驟（1.1）制備的MGESA電極上加入滾環模板CP，雜交反應1-5h；其中：滾環模板CP的濃度為1×10^-7mol/L-5×10^-5mol/L；

（1.3）向步驟（1.2）所得產物中加入RCA反應液，加超純水補足到設定體積，在30℃恒溫條件下反應1-5h，即得RCA/CP/HS-P/MGESA電極；所述RCA反應液包括：phi 29 DNA聚合酶1-10μL，phi29聚合酶緩沖溶液4-20μL，BSA0.8-4μL，dNTPs0.8-4μL；

（2）通過RCA擴增形成DNA長鏈，與碳納米管連接形成MGESA-RCA-MWCNTs，實現微間隙陣列電極的導通并產生信號；

（2.1）將1mg 的30-50μm多壁碳納米管MWCNTs分散在10mL含有聚乙二醇十八烷基醚（PEG）的PBS緩沖溶液中，超聲處理后，得到均一穩定的黑色分散液，以相同方式處理1-100μm長度的MWCNTs，將兩種MWCNTs分散液稀釋至相同濃度，按體積比1：1混合后，超聲處理待用；

（2.2）將制備的RCA / CP / HS-P / MGESA電極與步驟（2.1）制備的MWCNTs溶液在室溫下溫育2-3 h，然后用PBS溶液洗滌以終止反應，即得MWCNTs / RCA / CP / HS-P / MGESA電化學傳感平臺；

（3）用不同濃度的Fenton溶液產生·OH對DNA進行損傷，導致DNA-MWCNTs結構被破壞，使原本導通的電極不同程度斷開，在電化學阻抗測量中顯示明顯的電信號響應減小；

（4）通過電化學阻抗法進行·OH引起的DNA損傷測試。

2.根據權利要求1所述的一種基于微間隙陣列電極/滾環擴增技術檢測DNA損傷的電化學傳感方法，其特征在于步驟（4）中檢測·OH引起的DNA損傷方法如下：

（4.1）采用?OH來誘導DNA損傷，?OH的來源為Fenton試劑，向構建的MWCNTS/RCA/HS-P/MGESA修飾電極加入由H₂O₂和Fe²⁺配制而成的Fenton溶液，在37°C下溫育30-60 min；

（4.2）通過電化學阻抗法（EIS）對不同濃度Fenton反應誘導·OH損傷的DNA序列進行電化學測試，·OH濃度范圍為2.5x10^-12mol/L-1x10^-10mol/L；

（4.3）根據電化學交流阻抗法的原理，阻抗增大表明電極的連通受到了一定干擾，并體現為電荷轉移電阻（Rct）值增大；因此當·OH濃度增大，通過電化學阻抗法測定DNA鏈損傷的能斯特曲線逐漸升高，并且·OH濃度與DNA損傷程度在一定范圍內呈現較好的線性關系，即R = 2997.76549 ln (c)- 4402.421，R² = 0.991；其中，R為電荷轉移電阻，c為·OH濃度，據此實現對DNA損傷的檢測。