[發明專利]一種流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201710495241.1
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107402304A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 周繼章;藺俊麗;李兆才;婁中子
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及一種流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法，具體涉及一種以MIP表達蛋白建立的流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法。

背景技術

流產嗜性衣原體(Chlamydophila abortus)是一種專性細胞內寄生的革蘭氏染色陰性微生物，屬于衣原體科(Chlamydiaceae)嗜性衣原體屬(Chlamydophila)的一個成員，，具有廣泛的宿主嗜性，主要寄生于豬、牛、羊等多種動物生殖道黏膜表面的上皮細胞，造成生殖道黏膜受損，導致以母畜流產、死胎、弱胎，公畜睪丸炎、包皮炎等為特征的慢性接觸性傳染病，同時也也能夠感染人類，導致孕婦流產，是一種重要的人獸共患病病原。近年來，流產嗜性衣原體在我國流行較為嚴重，尤其是奶牛、牦牛、綿羊、山羊、豬等，嚴重阻礙了奶牛產業、牦牛產業等的進一步發展，并造成了巨大的經濟損失。此外，作為一種人獸共患病，流產嗜性衣原體不僅引起人的結膜炎，而且導致孕婦流產。因此，及時、及早的發現衣原體，并采用敏感、特異的診斷方法，在準確診斷動物流產嗜性衣原體病，提供科學防控流產嗜性衣原體病的診斷依據，促進養殖業健康發展，保證食品安全，保護人民身體健康方面尤為重要。

多年來，國內外對于流產嗜性衣原體的血清學診斷方法主要有間接血凝診斷試驗(IHA)和補體結合試驗(CFT)，但是這兩種方法均具有靈敏度低、特異性差、結果判斷主觀性強和不適合大批量檢測等特點，限制了它們在臨床中的廣泛應用。近年來，國內外學者對于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)抗體檢測方法進行了研究，取得了一定的進展。例如現有技術CN201110367644.0公開了一種檢測豬流產嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒是以重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP為包被抗原，以及現有技術中以重組多型性外膜蛋白POMP為包被抗原建立的豬流產嗜性衣原體病間接ELISA抗體檢測方法，但是這些現有技術均是針對特定一種動物開發的ELISA抗體間接檢測方法或試劑盒，適用范圍窄，不具有通用性，無法用于多種動物的衣原體檢測診斷，使用成本較高，難以普及；同時MOMP，POMP的表達蛋白主要以包涵體形式存在，還需經過變性溶解后，進行復性的繁瑣操作，使重組蛋白折疊成天然構象狀態，恢復其生物活性。

目前，還沒有關于流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法，而且雙抗原夾心法常常會由于試劑、材料、環境等因素，特別是待測樣品中的一些干擾性物質會引起非特異性結合，導致有一定程度的假陽性，影響了檢測結果的可信度。因此，雙抗原夾心法檢測目的抗體時，背景過高以及假陽率高始終是一個難以解決的問題。為此，尋求一種降低雙抗原夾心法的背景和假陽率，提高檢測的特異性的方法是大勢所趨。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種降低假陽率，提高檢測特異性的流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法。

本發明解決技術問題采用的技術方案是，一種流產衣原體抗體雙抗原夾心ELISA檢測方法，采用帶有S標記無His標簽的MIP重組蛋白作為包被抗原，以帶有His標簽無S標簽的MIP重組蛋白作為指示抗原和HRP標記的、抗His標簽的抗體，進行動物血清流產衣原體抗體的雙抗原夾心ELISA檢測。

進一步，所述雙抗原夾心ELISA反應條件分別是帶有His標簽的MIP重組蛋白的包被濃度為0.2μg/孔,血清稀釋度為1:100，HRP標記的帶有His標簽的MIP重組蛋白稀釋度為1:5000，封閉液為5％明膠，待測血清和具有His標簽的MIP重組蛋白均于37℃反應45min,底物于室溫顯色時間20min。

進一步，所述HRP標記的His標簽的MIP重組蛋白為酶標抗原。

進一步，所述雙抗原夾心ELISA檢測出陰陽臨界點為0.261。

進一步，所述帶有His標簽的MIP重組蛋白是由以下步驟構建而成：

(1)流產嗜性衣原體MIP蛋白的編碼基因序列擴增：以流產衣原體SX5基因組為模板，設計含有His標簽的指示抗原MIP蛋白基因的引物如SED ID NO：3和SED ID NO：4所示；擴增出含有His標簽巨噬細胞感染增強因子基因，進行PCR擴增產物的回收和純化得到含有His標簽的流產嗜性衣原體MIP蛋白的編碼基因；