[發(fā)明專利]一種促黃體激素類似物及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710494736.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107827987B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林俊生;劉軍偉;刁勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué);太平洋貫連有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/85
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 張浠娟

1.一種促黃體激素類似物，其特征在于，所述的促黃體激素類似物的編碼序列系攜帶有起始密碼子和信號(hào)肽編碼序列但刪除終止密碼子的LH的β亞基編碼序列與缺少起始密碼子和信號(hào)肽編碼序列但攜帶終止密碼子的LH的α亞基編碼序列與接頭序列l(wèi)inker按照LHβ-接頭序列-LHα的順序從N末端到C-末端連接起來(lái)；所述的接頭序列為Seq ID 2或Seq ID 10中的一種，對(duì)應(yīng)所述接頭序列的促黃體激素類似物的氨基酸序列為Seq ID 12和Seq ID20。

2.一種權(quán)利要求1所述的促黃體激素類似物的制備方法，其特征在于，其制備方法包括以下步驟：

步驟1、從Genebank獲得牛(bovine)LHα亞基編碼序列和LHβ亞基編碼序列，刪除LHβ的終止密碼子和LHα的起始密碼子；根據(jù)CHO-K1表達(dá)系統(tǒng)偏愛(ài)的密碼子豐度，將野生型LH的編碼序列密碼子進(jìn)行重組；設(shè)計(jì)接頭序列，根據(jù)接頭序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的帶有0個(gè)、1個(gè)、2個(gè)和4個(gè)O-糖基化和N-糖基化位點(diǎn)的接頭序列10個(gè)，在接頭序列上添加組氨酸標(biāo)簽(HHHHHH)，接頭序列兩端分別添加酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I，以引物的形式全序列合成，純化方式PAGE，合成量1OD，合成的接頭序列單鏈DNA-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟2、將含有全序列合成的野生型LH的重組載體pMD19-T Simple-LH9、含有全序列合成的密碼子偏愛(ài)型LH的重組載體pMD19-T Simple-LH10和空表達(dá)載體pcDNA3.1(+)分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收雙酶切線性化的pcDNA3.1(+)和LH(含接頭序列)片段，經(jīng)DNA連接酶連接，分別形成重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-LH9和pcDNA3.1(+)-LH10，構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染感受細(xì)胞E.coli DH5α，選取抗阿莫西林陽(yáng)性克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組載體并保存菌種，提取的質(zhì)粒載體限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定；

步驟3、分別置換連接序列，共構(gòu)建20個(gè)含10種不同連接序列的野生型和密碼子偏愛(ài)型的bLH表達(dá)載體；

步驟4、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述構(gòu)建的含有不同接頭序列的bLH表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-K1細(xì)胞中，取上清液做Western Blotting檢測(cè)，選取表達(dá)量高且攜帶組氨酸的重組bLH表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，通過(guò)G418篩選，上清液通過(guò)Western Blotting檢測(cè)；

步驟5、重組bLH表達(dá)株的單克隆化，取bLH表達(dá)株細(xì)胞放大培養(yǎng)作為種子庫(kù)；

步驟6、通過(guò)對(duì)相應(yīng)的各種候選序列的表達(dá)物的生物活性進(jìn)行比較而確定長(zhǎng)短效序列。