[發明專利]一種基于RPA檢測番茄黃化曲葉病毒的方法

有效

• 申請號: 201710494231.6
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107254552B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 周瑩;喬鑫;劉梅;張瑋;燕繼曄;喬廣行
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種基于RPA檢測番茄黃化曲葉病毒的方法。本發明提供了用于檢測番茄黃化曲葉病毒的引物對，為如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(b)由將序列表中序列1和序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a)中所述引物對功能相同的引物對。本發明中的RPA引物可有效擴增靶基因，特異性達100％，靈敏度為6×10⁵拷貝/μL；與番茄常見病毒病無交叉反應。本發明為育苗圃的苗木篩查提供了可用的快速檢測方法。對于防止番茄黃化曲葉病毒的擴散蔓延具有重要意義。

技術領域

本發明屬于植物病害診斷領域，涉及一種基于RPA檢測番茄黃化曲葉病毒的方法。

背景技術

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是引起番茄黃化曲葉病的重要病原，被感染的番茄植株表現曲葉、斑駁、黃化、節間縮短以及植株矮化等癥狀。我國于2006年在上海首次發現TYLCV，隨后該病害由南向北擴散，給番茄生產造成了嚴重影響。

番茄黃化曲葉病毒病害的綜合防治措施中，除使用抗病毒品種和對傳播介體進行防治外，預防該病毒病的發生也非常重要，而快速、準確地檢測病毒是預防工作的重要前提。

目前番茄黃化曲葉病毒的檢測方法主要包括生物學檢測、電子顯微鏡檢測、血清學檢測以及分子生物學檢測等技術。生物學檢測是將病毒接種于寄主植物上，根據典型癥狀來判斷，該方法直觀便捷，但對于具有類似癥狀的病毒較難分辨，而且耗時較長。電鏡檢測可以直接觀察病毒的形態結構以及病毒侵染寄主植物后所引起的植物超微結構變化，是一種最直接的觀察方法，但對于病毒的分類和歸屬較難判定，并且病毒的提純工作對技術要求高。血清學檢測是在免疫酶基礎上發展起來的免疫測定技術，該方法被廣泛用于植物病毒檢測。分子生物學PCR檢測主要是通過病毒的核酸來檢測病毒，它比血清學方法的靈敏度要高，能檢測到更高數量級的病毒，特異性強、操作簡便、可用于大量樣品檢測。自PCR技術發明以來，PCR已經成為病毒檢測一種普遍采用的方法。但由于PCR技術對儀器的依賴度高，需要精密的溫度循環儀器才能完成擴增過程。加之成本高、耗時長，這些局限性使其應用大多限制于條件完善的實驗室內，難以廣泛應用于現場檢測。

近年來，恒溫核酸擴增技術的出現恰可解決PCR技術的局限，它對儀器的要求大為簡化，反應時間明顯縮短，因而日益受到關注。重組酶聚合酶擴增技術(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)是恒溫核酸擴增技術的一種，可在常溫下進行反應，且反應快速、靈敏度高、特異性強、操作簡便。目前RPA技術在醫學病原物的快速診斷中得到了一些應用，農業領域中主要用于轉基因作物的檢測。專利《一種檢測GII型諾如病毒的試劑盒及其用途》(專利號：CN201310271924.0)公開了利用RPA技術檢測GII型諾如病毒的引物對和探針及包含所述引物對和探針的試劑盒。專利《應用RPA技術對轉基因水稻華恢1號品系特異性鑒定》(專利號：CN201310391525.8)和專利《Cry1Ab/Cry1Ac抗蟲基因RPA檢測方法》(專利號：CN201310390769.4)公開了利用RPA技術鑒定轉基因作物的引物及探針組合以及方法。用于植物病毒檢測的報道較少，番茄黃化曲葉病毒病是近幾年番茄上最嚴重的病害之一，快速、準確地檢測該病原對于病害防治至關重要。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種用于檢測番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellowleaf curl virus,TYLCV)的引物對。

本發明所提供的用于檢測番茄黃化曲葉病毒的引物對，具體為如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

(b)由將序列表中序列1和序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a)中所述引物對功能相同的引物對。