[發明專利]一種微載體懸浮培養CPB細胞生產鱖傳染性脾腎壞死病毒和鱖彈狀病毒的方法

有效

• 申請號: 201710493888.0
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107326016B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 李寧求;付小哲;胡松;林強;劉禮輝;梁紅茹;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N5/079;C12N5/02;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 舒勝英;胡輝

1.一種利用攪拌瓶和生物反應器微載體培養CPB細胞生產鱖傳染性脾腎壞死病毒和鱖彈狀病毒的方法，其特征在于，以攪拌瓶和生物反應器微載體培養的CPB細胞作為鱖傳染性脾腎壞死病毒和鱖彈狀病毒的生產細胞；該方法具體包括以下步驟：

1)CPB細胞在125ml攪拌瓶中的微載體初期培養：將CPB單一細胞懸液接種至含0.28～0.32g已預處理微載體的125mL細胞培養攪拌瓶中，細胞的接種量為每個微載體上28～32個細胞；以每隔41～43min攪拌2.5～3.5min的方式間歇攪拌4.8～5.2h后；補加一倍體積的細胞培養液使微載體的終濃度為2.8～3.2g/L，此時培養液體積為100ml；以39～41r/min進行連續攪拌；

2)CPB細胞在500ml攪拌瓶中的微載體初次放大培養：

當上步細胞長至平臺期時，將細胞消化后轉移至含已預處理微載體的500mL細胞培養攪拌瓶中，新舊微載體數的比例為2.8～3.2：1，以每隔41～43min攪拌2.5～3.5min的方式間歇攪拌4.8～5.2h后，補加細胞培養液使微載體濃度為2.8～3.2g/L，此時培養液體積為400ml；以44～46r/min進行連續攪拌；

4)CPB細胞在3L生物反應器中的微載體二次放大培養：

當上步細胞長至平臺期時，將細胞消化后移至含3.3g已預處理微載體的3L生物反應器中進行二次放大培養，以每隔41～43min攪拌2.5～3.5min的方式間歇攪拌4.8～5.2h后，補加細胞培養液至終體積1.5L，此時微載體濃度為2.8～3.2g/L，以54～56r/min進行連續攪拌；

5)鱖傳染性脾腎壞死病毒或鱖彈狀病毒制苗液的制備：

鱖傳染性脾腎壞死病毒制苗液的制備：CPB細胞二次放大培養后的第71～73h，靜置沉降微載體，去除上清液，用等體積孵育液洗滌，洗滌后以感染復數MOI為4.8～5.2加入鱖傳染性脾腎壞死病毒感染細胞，并補加無血清的孵育液使體系體積為終體積的一半，以39～41r/min每11～13min攪拌2.5～3.5min，持續進行1.8～2.2h后，補加剩余含血清的孵育液至終體積，接毒后第118～122h沉降微載體，收集上清液，凍融，離心取上清，過濾取濾液，得病毒制苗液；

鱖彈狀病毒制苗液的制備：CPB二次放大培養后的第95～97h，靜置沉降微載體，去除上清液，用等體積孵育液洗滌，吸出孵育液，以感染復數MOI為0.09～0.11加入鱖彈狀病毒感染細胞，并補加無血清的孵育液使體系體積為終體積的一半，以39～41r/min每11～13min攪拌2.5～3.5min，持續進行1.8～2.2h后，補加含血清的孵育液至終體積；接毒后第35～37h沉降微載體，收集上清液，凍融，離心取上清，過濾取濾液，得病毒制苗液。