[發(fā)明專利]一種檢測雙氫青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710493752.X
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107328932A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設計）人: 王保民;寧香雪;王冕;譚桂玉
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C07K14/765;C07K14/77;C07K1/107;C07K16/44;C07K16/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域中，一種檢測雙氫青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗體。

背景技術

青蒿素衍生物如青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素等對治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾具有高效、低毒、速效、復燃率低等顯著療效。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是東南亞、非洲應用較大的抗瘧疾藥物。

假冒、劣質(zhì)以及不符合標準的青蒿素藥物對瘧疾病情的防控造成了重大威脅，而這種偽劣假冒現(xiàn)象在東南亞、非洲等落后地區(qū)尤為突出。因此急需建立一種快捷、可靠的針對青蒿素及其衍生物的定性定量分析方法。

雙氫青蒿素的化學名為(3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-橋氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二氧七環(huán)-10(3H)-醇，CAS登記號為81496-81-3；71939-50-9；123930-80-3，分子式為C₁₅H₂₄O₅，相對分子量為284.34806，化學結構式見式(Ⅰ)。

目前國內(nèi)外已發(fā)表的文獻中，雙氫青蒿素檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。這些方法都需要昂貴的儀器設備，檢測費用高，操作時間長，操作技術要求高且不能用于現(xiàn)場檢測。另外，前人也曾制作出雙氫青蒿素相應抗體，但起靈敏度一般在100-500ng/mL同時對青蒿素其他衍生物如青蒿琥酯有較高的較差反應率，不能做到特異性檢測雙氫青蒿素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測雙氫青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗體。

本發(fā)明首先提供了雙氫青蒿素的檢測方法，所述方法包括利用抗血清或抗體實現(xiàn)雙氫青蒿素的檢測；

所述抗血清和所述抗體分別為利用式(Ⅱ)所示化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的抗血清和抗體；

上述方法中，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

上述方法中，式(Ⅱ)所示化合物與載體蛋白通過酰胺鍵連接。所述酰胺鍵是式(Ⅱ)所示化合物的羧基通過活潑酯與載體蛋白上的氨基形成的。所述偶聯(lián)物的結構式見式(Ⅲ)。

所述偶聯(lián)物的制備方法包括：在NHS和EDC的作用下促使式(Ⅱ)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)。制備所述偶聯(lián)物時，式(Ⅱ)所示化合物、NHS和EDC的摩爾比可為1：(1-5)：(1-5)。制備所述偶聯(lián)物時，所述反應的條件可為：0-50℃反應4-36小時。制備所述偶聯(lián)物時，式(Ⅱ)所示化合物與所述載體蛋白的摩爾比可為(5-30)：1；具體可為(15-17)：1，更具體可為15：1。所述偶聯(lián)物的制備方法具體如下：將0.036mmol式(Ⅱ)所示化合物、0.047mmol NHS和0.040mmol EDC，用有機溶劑(如DMSO)溶解，25℃攪拌反應6小時，然后滴加入含0.0024mmol載體蛋白的載體蛋白溶液(載體蛋白溶液具體是將0.0024mmol OVA溶于5mL pH7.5、0.1M的PBS緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時。

所述偶聯(lián)物的制備方法包括如下步驟：在NHS和EDC的作用下促使式(Ⅱ)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)。制備所述偶聯(lián)物時，式(Ⅱ)所示化合物、NHS和EDC的摩爾比可為1：(1-5)：(1-5)。制備所述偶聯(lián)物時，所述反應的條件可為：0-50℃反應4-36小時。制備所述偶聯(lián)物時，式(Ⅱ)所示化合物與所述載體蛋白的摩爾比可為(5-30)：1；具體可為(15-17)：1，更具體可為15：1。所述偶聯(lián)物的制備方法具體如下：將0.04mmol式(Ⅱ)所示化合物、0.052mmol NHS和0.044mmol EDC，用有機溶劑(如DMSO)溶解，25℃攪拌反應6小時，離心(離心參數(shù)具體可為：8000rpm離心5分鐘)收集上清液，然后滴加入含0.0024mmol載體蛋白的載體蛋白溶液(載體蛋白溶液具體是將0.0024mmol OVA溶于5mL pH7.5、0.1M的PBS緩沖液得到的)，4℃攪拌12小時。

上述方法中，所述抗血清和所述抗體分別可為利用所述偶聯(lián)物免疫動物得到的抗血清和抗體。所述動物具體可為哺乳動物，如小鼠。

上述方法中，所述雙氫青蒿素的檢測方法可采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)進行。

本發(fā)明還提供了下述P1)-P4)中任一所述產(chǎn)品：

P1)式(Ⅱ)所示化合物；

P2)所述偶聯(lián)物；