[發明專利]一種利用膜循環生物反應器分階段制備L-鳥氨酸和丁二酸的方法

有效

• 申請號: 201710492608.4
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107236769B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 吳昊;郝寧;許晟;陳可泉;姜岷
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P13/10
• 分類號: C12P13/10;C12P7/46;C12M1/12;C12M1/00;C12R1/15
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種利用膜循環生物反應器分階段制備L-鳥氨酸和丁二酸的方法，其特征在于，所述的膜循環生物反應器包括發酵罐、中空纖維膜組件和培養基儲罐；其中，發酵罐和中空纖維膜組件的進料口連通，中空纖維膜組件的透過液出口通過透過液出口支路與培養基儲罐相連，中空纖維膜組件濃縮液出口通過管道與發酵罐連通；各相連管道上均設有閥門；

所述的方法它包括如下步驟：

（1）將培養后的谷氨酸棒桿菌種子液接入發酵罐中的有氧發酵培養基，進行有氧發酵制備L-鳥氨酸；

（2）在步驟（1）中的有氧發酵完成后，將所得有氧發酵液經中空纖維膜組件的進料口泵入中空纖維膜組件中進行循環分離，透過液經中空纖維膜組件的透過液出口流出并收集，用于L-鳥氨酸的提取；濃縮液經中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發酵罐中；持續循環分離，直至發酵罐內的有氧發酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

（3）將厭氧發酵培養基通過透過液出口支路泵入中空纖維膜組件中，經濃縮液出口進入發酵罐中，再通過透過液出口支路泵入去離子水將中空纖維膜組件內殘留的厭氧發酵培養基和菌體壓入發酵罐中；厭氧發酵培養基和水都泵入完成后，在發酵罐中進行厭氧發酵制備丁二酸；厭氧發酵完成后，將所得厭氧發酵液經中空纖維膜組件的進料口泵入中空纖維膜組件中，透過液從中空纖維膜組件的透過液出口流出并收集，用于丁二酸的提取；濃縮液由中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發酵罐中；持續循環分離，直至發酵罐內的厭氧發酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

所述中空纖維膜組件中，中空纖維膜為微濾膜，膜孔徑為0.1~0.22μm；

所述的谷氨酸棒桿菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No .3991；

步驟（1）中，所述的培養后的谷氨酸棒桿菌種子液由谷氨酸棒桿菌接種于種子培養基上培養得到；

其中，

培養基配方為：葡萄糖20 g/L，K₂HPO₄?3H₂O 1.5 g/L，KH₂PO₄0.5 g/L，MgSO₄?7H₂O 0.4g/L，FeSO₄?7H₂O 20 mg/L，MnSO₄?H₂O 20 mg/L，尿素2.5 g/L，生物素100 μg/L，精氨酸200mg/L，維生素B1 200 μg/L，pH 7.0；110 ℃下滅菌10 min；

培養條件為：搖瓶裝液量10%v/v，接種量2%，30℃下200rpm震蕩培養10 h；

步驟（1）中，所述的有氧發酵培養基的配方為：葡萄糖 60~90 g/L，K₂HPO₄?3H₂O 1.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄?7H₂O 0.25 g/L，FeSO₄?7H₂O 20 mg/L，MnSO₄?H₂O 20 mg/L，(NH₄)₂SO₄ 40 g/L，ZnCl₂ 1 mg/L，CuSO₄ 0.2 mg/L ，生物素 100 μg/L ，精氨酸 200 mg/L ，維生素B1 200 μg /L，pH7.0；

步驟（1）中，所述的有氧發酵的條件為：接種量為3~5%v/v，發酵溫度為29~32℃，攪拌速度為300~500rpm；發酵過程中用氨水控制pH為6.7~7.0，并通入無菌空氣，通氣量為0.5~1.5VVM；發酵至殘留葡萄糖低于1g/L 時，終止發酵；

步驟（2）中，在有氧發酵完畢前2小時，對中空纖維膜組件進行化學消毒，具體操作如下：

用無菌水配制的4 g/L NaOH經透過液出口支路泵入中空纖維膜，循環清洗20min，清洗廢水經進料口支路和濃縮液出口支路排出，膜組件隨后用無菌水經透過液出口支路泵入將其洗至出水為pH 9以下；接著再將無菌水配制的5 g/L檸檬酸經透過液出口支路泵入中空纖維膜，循環清洗20min，隨后用無菌水將其洗至出水為pH 6以上，即完成中空纖維膜的化學消毒；

步驟（3）中，所述的厭氧發酵基的配方為：葡萄糖 40~80 g/L，K₂HPO₄?3H₂O 0.5 g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L， MgSO₄?7H₂O 0.5 g/L，FeSO₄?7H₂O 6 mg/L，MnSO₄?H₂O 6 mg/L，生物素 200μg/L ，維生素B1 200 μg /L，pH7.0；

步驟（3）中，所述的厭氧發酵的條件為：發酵溫度為29~32℃，攪拌速度為150~200rpm；發酵過程中用Na₂CO₃控制pH為6.5~6.8，并通入無菌CO₂氣體發酵，通氣量為0.1~0.2VVM；發酵至殘留葡萄糖低于1g/L 時，終止發酵。