[發明專利]一種從母體外周血檢測胎兒非整倍體染色體的方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201710490180.X
• 申請日: 2017-06-25
• 公開（公告）號: CN108342455B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 祝令香;郭永;王棟;劉燁;朱宏艷;楊文軍;王勇斗
• 申請（專利權）人: 北京新羿生物科技有限公司;新羿制造科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種從母體外周血檢測胎兒非整倍體染色體的方法，所述方法包括從母體外周血中獲得胎兒和母體游離DNA，篩選待測靶標區域，挑選靶向區域，設計相應的引物對和探針，進行多重微滴式數字PCR擴增和結果定量分析，根據不同熒光染料標記的陽性PCR產物液滴數的比例，來判斷母體外周血樣本中胎兒是否存在非整倍體染色體。

技術領域

本發明涉及數字PCR技術領域，具體涉及一種從母體外周血檢測胎兒非整倍體染色體的方法及其試劑盒。

背景技術

二代測序(NGS)技術已經廣泛用于從母體外周血DNA中檢測胎兒非整倍體染色體異常的臨床產前篩查當中。該技術大幅度取代了抽取14周后孕婦羊水或絨毛等傳統的侵入性檢查方法，有效規避了感染和流產帶來的醫療風險與心理壓力，代表了當前產前診斷和防止先天性缺陷兒出生的最新發展方向。但二代測序費用相對較高，從而極大的限制了受惠人群。同時測序技術的操作流程比較復雜，需要進行建庫和測序等多個步驟，而且由于通常母體外周血的胎兒DNA含量較低(5-20％)，常規建庫測序方法使得血漿中低含量的胎兒DNA異常會淹沒在母體DNA背景噪聲中，建庫過程原始信息丟失嚴重將成為其限制因素。為了避免假陰性的產生，在檢測中會降低Z-score的判讀標準，從而造成基于NGS的無創產前篩查技術存在假陽性高的問題。同時，由于NGS技術專業要求高、檢測流程及信息解讀標準化、檢測時間過長等原因也限制了其臨床應用，目前只有比較專業的臨床檢驗機構例如醫學檢驗所等進行檢測，普通臨床實驗室難以進行實驗操作和數據分析。因此需要一種更簡便、成本低廉的方法用于無創產前篩查領域。

發明內容

在本發明的一種實施方式中，提供一種從母體外周血檢測胎兒非整倍體染色體的方法，所述方法包括以下步驟：步驟1：從母體外周血中獲得胎兒和母體游離DNA；步驟2：篩選待測染色體和參照染色體的待測靶標區域；步驟3：在步驟2中篩選的待測靶標區域中分別挑選間隔大于200bp的相同數量的靶向區域；步驟4：對步驟3中挑選的靶向區域設計相應的引物對和探針，待檢染色體的探針和參照染色體的探針分別用不同的熒光基團進行標記；步驟5：對步驟3中挑選的靶向區域進行多重微滴式數字PCR擴增和進行結果定量分析；和步驟6：根據所述待測染色體和所述參照染色體的不同熒光染料標記的陽性PCR產物液滴數的比例，來判斷母體外周血樣本中胎兒是否存在非整倍體染色體。待測染色體包括常見的染色體非整倍體疾病所涉及到的染色體，例如，其中21號染色體三體會導致唐氏綜合征，又名21-三體綜合征或先天愚型，這是由于多出一條21號染色體所導致的疾病，發病率約為1/600-800。其它的染色體非整數倍體疾病還有，18-三體綜合征又稱愛德華氏綜合征，發病率約為1/4000-5000；13-三體綜合征又稱帕陶氏綜合征，發病率為1/5000-7600。參照染色體一般是指通常不產生染色體倍增或部分倍增、或染色體缺失的染色體，例如1-12號染色體。

在一種實施方式中，所述非整倍體染色體是單倍體、部分單倍體、三倍體、部分三倍體或五倍體。

在一種實施方式中，中所述待測染色體是人的13號染色體、18號染色體、21號染色體、X染色體或Y染色體；和所述參照染色體是人的1-12號染色體中任一個。

在一種實施方式中，步驟2中的待測靶標區域不含有SNP位點、GC含量為40-60％和無重復序列。

在一種實施方式中，步驟3中的靶向區域的數量至少為5、10、20、50、100、200、300、400或500個。

在一種實施方式中，步驟3中每個靶向區域的多核苷酸序列的長度是從20個堿基到500個堿基，優選地為從50個堿基到200個堿基。

在一種實施方式中，步驟4中的引物對退火溫度為50-60℃，所述引物對產生60-120bp長度的PCR產物。

在一種實施方式中，步驟4中待測染色體的檢測探針5’末端用6-FAM進行標記，3’末端用萃滅基團BHQ1或BHQ2標記；所述參照染色體的檢測探針在5’末端用VIC或TET進行標記，3’末端用萃滅基團BHQ1或BHQ2標記。