[發(fā)明專利]體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心室肌細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710487844.7
• 申請(qǐng)日: 2013-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN107460164B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬躍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院生物物理研究所
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心室肌細(xì)胞的方法，其是通過在體外維持、擴(kuò)增、培養(yǎng)多能干細(xì)胞，使其定向分化為心室肌細(xì)胞，其特征在于，在多能干細(xì)胞分化的中期即由中胚層細(xì)胞或心肌前體細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的時(shí)期，向培養(yǎng)基中加入可直接或間接激活Smad1/5/8信號(hào)通路的物質(zhì)；

在多能干細(xì)胞分化的中期，還包括當(dāng)培養(yǎng)基中不含有維甲酸或其合成所需的底物時(shí)，向其中加入維甲酸受體γ（RARγ）的激活劑，其中所述激活劑的終濃度范圍為0.001-100μM；

所述可直接或間接激活Smad1/5/8信號(hào)通路的物質(zhì)為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4），其終濃度為0.01-1200ng/mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能干細(xì)胞為來自于哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在多能干細(xì)胞分化的初期，向培養(yǎng)基中加入具有促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的物質(zhì)；其中，多能干細(xì)胞分化的初期是指從干細(xì)胞分化成中胚層細(xì)胞的時(shí)期。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述具有促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的物質(zhì)為BMP4、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、激活素A（Activin A）、Noggin、Dorsomorphin、6-溴靛玉紅-3'-肟（6-bromoindirubin-3′-oxime，BIO）中的至少一種；

其中，添加的生長(zhǎng)因子的終濃度為0.01-1200ng/mL，其它物質(zhì)的終濃度為0.001-100μM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1，3,4任一所述的方法，其特征在于，在多能干細(xì)胞分化的中期，還向培養(yǎng)基中添加具有抑制Wnt信號(hào)通路的物質(zhì)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有抑制Wnt信號(hào)通路的物質(zhì)為dickkopf同源物1（dickkopf homolog 1，DKK1）、IWP、Wntresponse的抑制劑中的至少一種；其中，添加的DKK1的終濃度為0.01-1200ng/mL，其它物質(zhì)的終濃度為0.001-100μM。

7.促進(jìn)干細(xì)胞分化為心室肌細(xì)胞的方法，該方法包括激活中胚層細(xì)胞中的Smad1/5/8信號(hào)通路；其中，所述中胚層細(xì)胞由干細(xì)胞分化而來；

通過在不含有維甲酸或其前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，并使處于分化中期的多能干細(xì)胞或中胚層細(xì)胞與RARγ激活劑發(fā)生接觸，從而激活Smad1/5/8信號(hào)通路。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞為誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞。

11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，由干細(xì)胞分化成中胚層細(xì)胞是通過使未分化的干細(xì)胞與以下物質(zhì)中的至少一種發(fā)生接觸；所述物質(zhì)為bFGF、BMP2、BMP4、ActivinA、BMP拮抗劑、BMP信號(hào)通路抑制劑、Wnt3a信號(hào)通路激活劑。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述BMP拮抗劑為BMP4拮抗劑。

13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述BMP拮抗劑為Noggin。

14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述BMP信號(hào)通路抑制劑為Dorsomorphin。

15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述Wnt3a信號(hào)通路激活劑為GSK-3α/β的ATP-競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。