[發(fā)明專利]產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710485003.2
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107164400A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張正竹;李萌萌;鄧威威;孫瑩;潘思安
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 北京市京大律師事務(wù)所11321
• 代理人: 王凝,李洪群

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種新的產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明主要利用以黃嘌呤為甲基受體的咖啡堿合成代謝途徑，將茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1和酵母鳥嘌呤脫氨酶基因GUD1共同導(dǎo)入大腸桿菌中，構(gòu)建獲得一種能在體外發(fā)酵生產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組大腸桿菌工程菌。該工程菌能在不添加任何底物的條件下，同時高產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿，產(chǎn)量分別達到4.17mg/L和20.3mg/L，且產(chǎn)物在發(fā)酵液中，易分離純化，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲基黃嘌呤屬于嘌呤生物堿類，是黃嘌呤甲基化后的衍生物，根據(jù)其甲基化位置及數(shù)量的不同，可分為1-甲基黃嘌呤、3-甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、3，7-二甲基黃嘌呤(可可堿)、1，3-二甲基黃嘌呤(茶葉堿)、1，7-二甲基黃嘌呤和1，3，7-三甲基黃嘌呤(咖啡堿)。自然界中大約有13個目100多種植物中均含有甲基黃嘌呤類化合物。其中咖啡堿是存在于植物中的天然生物堿，也是茶葉中嘌呤堿的主體成份，對人體具有多種生理作用。適量攝入咖啡堿可以幫助人體適當?shù)厣哐獕?，增加血液中的兒茶酚胺的含量，增強血液中高血壓蛋白原酶的活力，提高血清中游離脂肪酸的水平，利尿和增加胃酸的分泌等。茶葉堿作為茶葉中的特征性嘌呤生物堿，具有與咖啡堿相似的利尿、興奮神經(jīng)等生理功能。此外，茶葉堿具有極強的舒張支氣管平滑肌的作用，有很好的平喘作用，可被用于支氣管喘息和抗灸的治療。

咖啡堿和茶葉堿作為重要的食品添加劑和藥用原料，其主要來源于化學(xué)合成，存在附產(chǎn)物多且污染環(huán)境的弊端。而來源于茶葉或咖啡中天然提取的咖啡堿，則存在原料和加工成本高，易產(chǎn)生有害物殘留等弊端。因此，利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建重組工程菌，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的方法具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有利用重組大腸桿菌發(fā)酵法無底物生產(chǎn)咖啡堿的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對目前市場上合成制備咖啡堿和茶葉堿存在成本高、污染環(huán)境、提取率低等缺點，提供一種利用大腸桿菌實現(xiàn)無底物發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿和茶葉堿的新方法。

本發(fā)明構(gòu)思如下：利用以黃嘌呤為甲基受體的咖啡堿合成代謝途徑來生產(chǎn)咖啡堿，通過將茶樹咖啡堿合成酶基因在大腸桿菌中過量表達。同時，為了進一步提高咖啡堿和茶葉堿的產(chǎn)量，高表達了酵母鳥嘌呤脫氨酶基因，以提高前體物質(zhì)黃嘌呤的供應(yīng)量。利用構(gòu)建的產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組基因工程菌，可以在不添加任何底物和碳源的LB培養(yǎng)基中，直接發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿和茶葉堿。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種重組表達載體，其含有至少1個茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1表達盒以及至少1個酵母鳥嘌呤脫氨酶基因GUD1表達盒。其中，所述表達盒中的啟動子選自Tac、Trp、Tac、IPL或T7啟動子，所述重組表達載體選自pET系列、pGEX系列、pMAL系列或pRSF系列。

優(yōu)選地，所述重組表達載體的出發(fā)載體為pRSF-Duet-1。

本發(fā)明還提供一種產(chǎn)茶葉堿和咖啡堿的重組基因工程菌，其是將茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1和酵母鳥嘌呤脫氨酶基因GUD1共同導(dǎo)入工程菌中表達而成的重組基因工程菌。其中，所述工程菌為大腸桿菌工程菌，可選擇的表達菌株包括Rosetta(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS等，優(yōu)選BL21(DE3)。

所述的重組基因工程菌是將上述重組表達載體導(dǎo)入工程菌中表達而成。

所述的重組基因工程菌可按照如下方法構(gòu)建獲得，將茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1和酵母鳥嘌呤脫氨酶基因GUD1分別構(gòu)建到不同表達載體上，然后將含有基因TCS1的表達載體以及含有基因GUD1的表達載體共同導(dǎo)入工程菌中表達而成；或者，將上述重組表達載體導(dǎo)入工程菌中表達而成。