[發明專利]一種基于大豆低聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710483487.7
• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN107337706A
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 汪少蕓;陳惠敏;王文龍;陳旭;蔡茜茜;方衛東
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;A01N1/02
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊,林文弘

技術領域

本發明具體涉及一種基于大豆低聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法及應用，屬于生物、食品加工技術領域。

背景技術

抗凍蛋白，俗稱冰結構蛋白，又叫作熱滯蛋白，首先于1969年由 Devries 在南極海峽的一種極地魚（Trematomus borchgrevinki）的血液中發現。抗凍蛋白具有低溫保護活性，可以作為冷凍保護劑應用于醫學、生物及食品加工等領。如抗凍蛋白應用于組織、細胞及微生物的低溫保存，可以顯著提高其冷凍存活率；抗凍蛋白能減少冷凍食品在低溫凍藏過程形成的冰晶及其重結晶對食品造成的品質劣變，提高冷凍食品的穩定性。

抗凍蛋白的抗凍活性主要來源于抗凍蛋白中的某些活性片段，并不是整個蛋白在起作用。汪少蕓等人通過酶解技術從牛皮、豬皮及魚皮等不同來源的膠原蛋白中酶解、分離出具有高抗凍活性的多肽片段。

近年來有研究發現重結晶抑制活性對于抗凍蛋白發揮冷凍保護作用起到了至關重要的作用，然而抗凍蛋白的熱滯活性和冰結合特性對于當凍藏溫度低于熱滯活性溫度區間的生物材料（如細胞、血液、組織）反而起到破壞甚至致死作用，主要因為當凍藏溫度低于熱滯活性溫度范圍時，冰晶生長不受控制而快速轉變成針狀結構，進而導致細胞損傷和解凍后細胞存活率的下降。這也是阻礙天然抗凍蛋白（或肽）作為冷凍保護劑進行實際應用的主要因素。因此，近年來國際研究開始致力于開發一些具有重結晶抑制活性而沒有熱滯活性的新型抗凍蛋白，基于糖基化修飾的抗凍蛋白就是這類活性物質的一種。例如一個由4個 Ser-Gly-Gly 三肽重復的肽鏈為骨架并通過 Ser 殘基的碳端連接一個半乳糖苷基形成的抗凍肽就發現具有很強的重結晶抑制活性而沒有熱滯活性。此外，研究還發現糖基種類和肽鏈骨架中糖基化位置及氨基酸殘基類型對重結晶抑制活性有著顯著的影響作用，如半乳糖基修飾的抗凍肽重結晶抑制活性比甘露糖基修飾的抗凍肽強，而脯氨酸由于具有限制的旋轉角可使蛋白在溶液中具有明顯二級結構，因此一些含脯氨酸的具有較強的重結晶抑制活性。

大豆低聚糖是一種低甜度、低熱量的甜味劑，其甜度為蔗糖的70%，其熱量是每克8.36千焦耳，僅是蔗糖熱能的1/2，而且安全無毒。大豆低聚糖主要分布在大豆胚軸中，其主要成分為水蘇糖、棉子糖。大豆低聚糖的保溫、吸濕性比蔗糖小，但優于果葡糖漿。大豆低聚糖具有通便潔腸、促進腸道內雙歧桿菌增殖、降低血清膽固醇、保護肝臟、抑制腸內腐敗物質的生成的作用。適用于中老年便秘患者、生活不規律的人、運動缺乏的人等。

因此，本發明將不同來源的抗凍多肽與大豆低聚糖通過糖基化修飾手段，化學合成抗凍糖肽。所合成的抗凍糖肽的抗凍活性顯著高于原始抗凍多肽，可以廣泛應用于細胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；并且該方法安全、易于控制，可以大規模工業化生產。

發明內容

本發明目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于大豆低聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法及應用。添加本發明抗凍糖肽的細胞、組織、器官、微生物的冷凍存活率均顯著提高；將本發明應用到冷凍保藏食品中，可以很好地保持冷凍食品原有品質的穩定性，顯著降低冷凍損傷引起的食品品質劣變。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于大豆低聚糖修飾的抗凍糖肽的制備方法，按照如下方法制備：

將抗凍多肽和大豆低聚糖按照質量比為1:1 ~ 1:5的比例溶解于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，溶液最終濃度為5 ~ 15%（w/v），攪拌使其充分溶解；然后在60 ~ 80 ℃、pH為8.0 ~ 9.0條件下反應1 ~ 2 h；反應結束后，立即放在0 ℃的水中冷卻以終止反應，反應后的溶液冷凍干燥，得到所述的大豆低聚糖修飾的抗凍糖肽凍干粉。

所述的抗凍多肽粉的原料來源于豬皮、牛皮、魚皮或魚鱗。

所述的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的pH為7.6~8.0，其中NaH₂PO₄為0.2 M，Na₂HPO₄為0.2 M。

所述的攪拌時間為10 ~ 20 min；所述的冷卻時間為15~30 min。

如上所述的制備方法制得的抗凍糖肽的用途，所述的抗凍糖肽制備用于細胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存。

本發明所提供的技術方案具有如下優勢：

（1）本發明所用的抗凍多肽原料來源于食品源下腳料，具有安全無毒、來源廣泛，價格便宜等優勢；

（2）本發明提供的抗凍糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；