[發明專利]一種檢測豬乙型腦炎病毒抗體的試劑盒

有效

• 申請號: 201710482895.0
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107422117B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 蓋新娜;張瑞敏;楊漢春;郭鑫;周磊
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.一種試劑盒在非疾病診斷目的的檢測豬乙型腦炎病毒抗體中的應用，其特征在于，

所述的試劑盒包括抗原蛋白或抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白的包被濃度為0.5μg/mL，所述抗原蛋白為在

SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；

其中，SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白是以pCMV-NS1質粒為模板，PCR擴增豬乙型腦炎病毒SA14-14-2非結構蛋白NS1的基因序列，克隆入pGEX-6p-1載體，轉化E.coliBL21(DE3)，PCR鑒定并篩選陽性重組菌，SDS-PAGE觀察重組菌中目的蛋白的表達情況，質譜鑒定融合表達的目的蛋白，并應用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠Glutathione-Sepharose beads 4B對重組蛋白進行純化得到的NS1重組蛋白；具體純化步驟為：

包涵體的洗滌：加入終濃度為0.8mM的IPTG，37℃180r/min條件下誘導表達400mL重組菌；收集菌體于100mL離心管中，12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用無菌PBS洗1次，再用10mL PBS重懸沉淀；將其置于冰上，用大探頭超聲裂解細菌，條件如下：工作2s，間歇8s，直至液體澄清；4℃12000r/min離心15min；沉淀用10mL PBS重懸，加入0.2mL 20％SKL，劇烈震蕩后置4℃冰箱保存；

透析復性：將4℃過夜的10mL液體10000r/min離心15min，取上清，加入20％PEG 4000至終濃度為0.2％，同時加入50mmol/L的氧化性谷胱甘肽至終濃度為1mmol/L，加入100mmol/L還原性谷胱甘肽至終濃度為2mmol/L，4℃靜置2h；

處理透析膜：2％NaHCO₃，1mM pH8.0的EDTA-Na₂溶液煮沸10min；再用1mM pH8.0的EDTA-Na₂溶液煮沸10min，蒸餾水沖洗干凈；

透析：將純化的蛋白加入透析膜，兩端扎緊，放到4℃PBS溶液中進行透析，磁力攪拌器不斷攪拌，12h換一次PBS溶液，透析48h；

還原性谷胱甘肽洗脫：將透析液10000r/min離心10min，收集上清，加入適量Glutathione Sepharose，置4℃混合器中過夜，使其充分結合；將混合液加到過濾柱，收集1mL流穿液，待液體流完后，beads用PBS洗滌，加入適量的GSH洗脫液，于4℃搖床充分混合30min，收集洗脫液，得到純化的NS1重組蛋白；

所述試劑盒還包括包被液、酶標二抗、封閉液、化學發光物質、化學發光檢測儀和可讀性載體；

所述包被液為0.05mol/L、pH9.6的NaCO₃-NaHCO₃緩沖液；

所述封閉液為5％小牛血清；

化學發光物質中魯米諾Luminol工作濃度為0.1mmol/L、對碘苯酚PIP工作濃度為0.2mmol/L，過氧化氫工作濃度為0.25mmol/L，Tris-HClpH為8.5；

所述可讀性載體上記載了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶標二抗檢測的CLEIA方法；

所述CLEIA方法中抗原蛋白的包被條件為4℃包被過夜，血清用NaCO₃-NaHCO₃緩沖液稀釋，稀釋度為1:400；發光底物最佳反應時間為5min；酶標二抗用0.5％脫脂乳稀釋，酶標二抗的稀釋度為1:10000；

所述試劑盒的封閉條件為37℃30min；

血清加入后作用條件為37℃反應45min；根據待測樣本化學發光值判斷待測樣本是否感染豬乙型腦炎病毒：若待測樣本化學發光值大于等于82538，則待測樣本感染或候選感染豬乙型腦炎病毒；若待測樣本化學發光值小于62798，則待測樣本未感染或候選未感染豬乙型腦炎病毒；兩者之間為可疑。

2.權利要求1所述的應用，其特征在于，用于檢測或輔助檢測待測豬乙型腦炎疫苗是否免疫合格；

所述試劑盒中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列是如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所表達的非結構蛋白NS1；

由于該蛋白為病毒的非結構蛋白，僅在病毒增殖時才可以復制表達，在滅活疫苗免疫豬群中不會表達并產生相應的抗體；

從而，豬乙型腦炎病毒NS1蛋白抗體的檢出可以用于區分滅活疫苗免疫豬及野毒感染豬。

3.權利要求1所述的應用，其特征在于，可用于豬乙型腦炎疫苗免疫豬群的抗體水平監測。