[發明專利]新月藻活性蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 201710482175.4
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107216367A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 張海玲
• 申請（專利權）人: 舟山富晟食品科技有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/14;A61P29/00;A61P35/00;A61P37/04;A61P39/06;A61P7/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，尤其是涉及新月藻活性蛋白的制備方法。

背景技術

微藻作為優良的天然餌料被廣泛應用于水產養殖，是多種軟體動物、甲殼類幼體和浮游動物（如輪蟲）的主要食源。微藻的餌料價值與許多因素有關，包括細胞大小、細胞壁的可消化程度和細胞內容物的生化組成，尤以后者最為重要。很早就有人注意到環境因子的改變對微藻生長及生化成分的影響，后續研究相繼闡述了各種微藻在不同的培養基配方、不同的培養方式以及不同的溫度、光強、通氣量、鹽度、QD、光周期和光質下細 胞內生化成分的變化。新月藻(Closlerium)屬于綠藻門，接合藻月、鼓燕科。已記錄的超過300種，生活在各種談水水體中。新月藻為單細胞體，細胞為新月形，中央有一核，核兩邊各有一個葉綠體。葉綠體的表面有縱的條狀突起，橫切面呈芒狀；葉綠體中有1列造粉核。細胞兩端各有一個液泡，其中有轉動的石膏結晶。與新月藻同類的還有鼓藻，但細胞形狀不一樣。鼓藻也是單細胞體，由2個“半細胞”和中間窄的藻腰組成。生殖方式與新月藻類相同。它們都屬于綠藻。大多數可作食用或飼料。綠藻向大自然釋放出大量的氧氣并含有大量的蛋白質，綠藻對水體自凈和工業上都有相當大的作用。

現有技術如授權公告號為CN 102020705 B的中國發明專利，公開了一種螺旋藻分離蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)螺旋藻細胞破碎脫色脫腥脫脂物料的制備；(2)稀鹽溶液提取蛋白與離心處理；(3)pH梯度分段調酸沉淀蛋白與調節中性；(4)超高溫瞬時滅菌和噴霧干燥。應用該方法生產出的螺旋藻分離蛋白具有色澤淺、腥味淡、蛋白質含量高、溶解性好和易消化的優點，可作為一種優質全價蛋白質營養補充劑或添加劑應用，但是該制備方法采用超微粉碎處理進行細胞破碎，破碎不徹底。

發明內容

本發明的目的在于提供一種活性蛋白純度高、得率高，工藝簡單有效，生產成本低，產量大，適合大規模制備的新月藻活性蛋白的制備方法。

本發明針對上述技術中提到的問題，采取的技術方案為：新月藻活性蛋白的制備方法，包括粗細胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體包括以下步驟：

細胞破碎：配置含水率為96-98%的藻液，加入功能蛋白肽，選用濃度為0.5-1%的PBS緩沖液作為提取溶劑，在均質壓力為23-26MPa條件下均質2-3次，保證每次從均質機流出的蛋白混合液的溫度≤40℃，然后經3-5℃、7000-9000rpm的低溫離心機離心18-22min，上清液即為蛋白粗提液，該步驟中PBS緩沖溶液對藍藻細胞壁的作用，削弱了細胞壁的強度，從而使細胞壁在勻漿下更容易破碎，另外，PBS緩沖液體系是弱酸性體系，接近生理環境，更利于藻蛋白活性的保持。高壓均質機中的新月藻，通過可調高壓均質閥，在驟然失壓狀態下，產生高速剪切沖擊現象，強烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成極細的均勻的乳化物態的分散物，高壓勻漿破碎新月藻細胞釋放藻蛋白，能夠批量化破碎藻細胞，利用工業化生產；

鹽析：向蛋白粗提液中加入(NH₄)₂SO₄至25-35%飽和度，3-5℃下靜止11-13h，然后在3-5℃、4000-6000rpm下離心20-25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質得溶解度降低而沉淀析出，該方法優點在于硫酸銨濃度變化具有連續性，鹽析效果好，節約能耗；

雙水相萃取：將聚乙二醇和無機鹽配成pH為5.8-6.5，聚乙二醇濃度為15-17%，無機鹽濃度為11-13%的雙水相體系，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術是一種新型的萃取分配技術，其反應條件溫和，容易工藝放大，分相時間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；

超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為20-40KDa超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為新月藻活性蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會減小甚至有所增加，該蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能夠清除活性氧，能通過驅除自由基從而表現出抗炎活性，蛋白的促紅細胞生成素活性較高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物的飼料或養魚餌料。