[發(fā)明專利]基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710479767.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107314965B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁顯廷;張婷;李軼洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 馬鞍山普梅森醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14;G01N27/62
• 代理公司: 安徽知問(wèn)律師事務(wù)所 34134
• 代理人: 郭大美

1.基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)全血樣本的采集和運(yùn)輸：采集全血樣本，樣本中添加抗凝劑，常溫保存運(yùn)輸；

(2)PBMC細(xì)胞分離：采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液對(duì)全血樣本中的細(xì)胞進(jìn)行分離，具體步驟為：用生理鹽水/PBS緩沖液/Hanks液將全血樣本1：1稀釋后，轉(zhuǎn)移至含1倍體積Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，離心，吸出中層白色的PBMC細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以無(wú)血清DMEM/1640離心清洗后，再用無(wú)血清的DMEM/1640重懸細(xì)胞沉淀；

(3)細(xì)胞活性染色：采用順鉑對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行染色，染色時(shí)間控制在5-10min，染色結(jié)束后離心去上清液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸；

(4)細(xì)胞刺激：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30min，使細(xì)胞恢復(fù)“靜息”狀態(tài)，并根據(jù)適當(dāng)?shù)拇碳の锛按碳し椒▽?duì)細(xì)胞進(jìn)行分組刺激；

(5)細(xì)胞固定：對(duì)步驟(4)中重懸的細(xì)胞進(jìn)行PFA固定、凍存；

(6)表面抗體染色：將PFA固定、凍存的細(xì)胞融化后，重懸，加入細(xì)胞染色緩沖液，離心去除上清后，加入Blocking Mix重懸，常溫靜置后加入cocktail混勻；

(7)胞內(nèi)磷酸化蛋白染色：將表面抗體染色后的細(xì)胞用PBS緩沖液和甲醇處理后，用cell staining Buffer重懸，加入磷酸化抗體cocktail混勻，常溫孵育之后用CellStaining Buffer清洗去上清；胞內(nèi)磷酸化蛋白染色的具體步驟為：將表面抗體染色后的細(xì)胞用PBS緩沖液混勻后放置冰上，然后加上預(yù)冷的甲醇混勻，放置冰上15min以上，離心棄上清，用cell staining Buffer重懸，加入等體積的磷酸化抗體cocktail混勻；

(8)單細(xì)胞標(biāo)記：步驟(7)中染色后的細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，滴入含有金屬元素標(biāo)記物的cell intercalation溶液進(jìn)行標(biāo)記，隨后分別用Cell Staining Buffer和水進(jìn)行清洗，最后將細(xì)胞重懸于含有EQ beads的水中保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：所述步驟(1)中全血樣本常溫保存的溫度范圍為15-35℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：所述步驟(1)中的抗凝劑為肝素或者檸檬酸鹽。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：步驟(4)中所述的刺激物為可以引起細(xì)胞蛋白和基因調(diào)控變化的藥物或激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干擾素、生長(zhǎng)激素。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：步驟(5)中細(xì)胞固定的具體步驟為：將步驟(3)中重懸的細(xì)胞加入等體積的2×固定液混勻，孵育后加入0-4℃的Cell Staining Buffer，然后離心分離，用凍存液重懸細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：步驟(6)的Blocking Mix溶液中包括Fc Receptor Blocking Solution和CellStaining Buffer，兩者的體積比為1:10；cocktail溶液中含有抗體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：步驟(6)的活性染色培養(yǎng)基中含有0.5％BSA+0.02％NaN₃。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于流式結(jié)合ICP-MS單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，其特征在于：步驟(8)中的金屬元素標(biāo)記物為Ir或者Rh。