[發明專利]一種優化的RNA高通量測序文庫構建的方法及其應用

在審

• 申請號: 201710479123.1
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107385018A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 裴熙祥;孫孝政
• 申請（專利權）人: 哈爾濱博泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種優化的RNA高通量測序文庫構建的方法，其特征在于采用RNase III進行待測RNA樣本打斷、采用RNA連接酶連接接頭、采用反轉錄酶和熱啟動高保真DNA聚合酶體系進行一步法反轉錄和加標簽PCR構建高通量測序文庫。

2.一種快速進行RNA單分子測序文庫構建的方法其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1）待測序的RNA樣本片段化；

2）片段化mRNA的純化；

3）片段化的mRNA加接頭；

4）一步法反轉錄和cDNA index PCR；

5）PCR產物片段大小篩選和純化。

3.根據權利要求1和權利要求2所述的待測序RNA樣本，其特征在于所述RNA樣本可以為mRNA樣本、rRNA樣本、單鏈病毒RNA樣本、lncRNA樣本等各種類型的用于高通量測序文庫構建的RNA樣本。

4.根據權利要求2所述的待測序RNA樣本片段化，其特征在于采用RNase III對所述待測序RNA樣本進行打斷，打斷后產生突出的5’端磷酸基團和3’端羥基基團。

5.根據權利要求2所述的片段化mRNA加接頭，其特征在于采用T4 RNA連接酶I對所述片段化的mRNA進行加接頭反應。

6.根據權利要求1、2、5所述接頭，其特征在于所述接頭包括一條單鏈RNA接頭和一條單鏈DNA接頭；單鏈RNA接頭和單鏈DNA接頭序列可以但不局限于為Illumina測序平臺接頭序列，Illumina測序平臺接頭序列如下面所述NO.1和NO.2所示：

NO.1: 5’-ACACUCUUUCCCUACACGACGCUCUUCCGAUCU-3’

NO.2: 5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’。

7.根據權利要求2所述一步法反轉錄和cDNA index PCR，其特征在于采用多點突變改造的反轉錄酶Thermo-script RTase進行反轉錄，采用熱啟動高保真DNA聚合酶進行cDNA index PCR。

8.根據權利要求7所述的index PCR，其特征在于所述index PCR引物可以為任何適用于Illumina測序平臺的index PCR引物。

9.一種優化的RNA高通量測序文庫構建的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含權利要求1和權利要求4所述的RNase III及其緩沖液，權利要求5所述的T4 RNA連接酶I及其反應緩沖液，權利要求6所述的單鏈DNA和單鏈RNA接頭，權利要求7所述的反轉錄酶Thermo-script RTase、熱啟動高保真DNA聚合酶及其反應緩沖液，權利要求8所述的index PCR引物。

10.根據權利要求1和權利要求2所述的方法在RNA高通量測序文庫構建中的應用。