[發明專利]一種重組人PCSK9蛋白在CHO?K1細胞中的表達純化方法

在審

• 申請號: 201710478648.3
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN107267491A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 呂志儉;蘭翀;吳敏;豆艷麗
• 申請（專利權）人: 黃河科技學院
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/85
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙)61223
• 代理人: 俞曉明

1.一種重組人PCSK9蛋白在CHO-K1細胞中的表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，真核表達載體pCMV-pcsk9-His的構建

根據人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后將pcsk9基因整合入真核表達載體pCMV-C-His，得到真核表達載體pCMV-pcsk9-His；

S2，CHO-K1細胞的轉染

培養CHO-K1細胞匯合度達到80％時，用真核表達載體pCMV-pcsk9-His轉染CHO-K1細胞；

S3，細胞培養、表達

CHO-K1細胞轉染后傳代培養，在CHO-K1細胞表達出重組人PCSK9蛋白，得到CHO-K1細胞培養液；

S4，重組人PCSK9蛋白的純化

S41，親和層析

S411，取Ni Sepharose excel樹脂，裝配成親和層析柱，用BufferⅠ平衡Ni Sepharose excel樹脂；

S412，取CHO-K1細胞培養液，流經平衡好的Ni Sepharose excel樹脂；

S413，用BufferⅠ繼續平衡Ni Sepharose excel樹脂；

S414，用BufferⅡ洗脫Ni Sepharose excel樹脂，收集親和層析洗脫液；

S415，用截留分子量30KD超濾管將親和層析洗脫液濃縮，得到濃縮液；

S42，尺寸排阻層析

S421，取Superdex 200 prep grade樹脂，裝配成尺寸排阻層析柱，用Buffer Ⅲ平衡Superdex 200 prep grade樹脂；

S422，用所述濃縮液流經Superdex 200 prep grade樹脂，收集流出液；

S423，用截留分子量30KD超濾管對15mL流出液進行溶液過濾，直至溶液的電導率值小于5mS/cm，棄去濾出液，收集截留液；

S43，陰離子交換層析

S431，取Q sepharose Fast flow樹脂，裝配成陰離子交換層析柱，BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow樹脂；

S432，將所述截留液流經Q sepharose Fast flow樹脂；

S433，用BufferⅣ繼續平衡Q sepharose Fast flow樹脂；

S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow樹脂；

S435，用BufferⅥ洗脫Q sepharose Fast flow樹脂，收集陰離子交換層析洗脫液；

S436，用截留分子量30KD超濾管對陰離子交換層析洗脫液進行濃縮脫鹽，得到純化的重組人PCSK9蛋白；

其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH₂PO₄、咪唑、NaCl、雙蒸水配制而成，pH均為7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH₂PO₄、NaCl、雙蒸水配制而成，pH均為7.4。

2.根據權利要求1所述的重組人PCSK9蛋白在CHO-K1細胞中的表達純化方法，其特征在于，

S411中，用Buffer Ⅰ平衡Ni Sepharose excel樹脂的流速為2mL/min；

S412中，取CHO-K1細胞培養液，以2mL/min的流速流經平衡好的Ni Sepharose excel樹脂；

S413中，用BufferⅠ繼續平衡Ni Sepharose excel樹脂的流速為2mL/min。

3.根據權利要求1所述的重組人PCSK9蛋白在CHO-K1細胞中的表達純化方法，其特征在于，

S421中，取120mL的Superdex 200 prep grade樹脂，裝配成尺寸排阻層析柱，柱高60cm，柱直徑是16mm，用BufferⅢ平衡Superdex 200 prep grade樹脂的流速為1mL/min；

S422中，用所述濃縮液流經層析柱的流速為1mL/min。