[發明專利]基于FRET技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法

在審

• 申請號: 201710476924.2
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107177686A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 李延斌;王靈;王蓉暉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物傳感器領域，涉及食源性致病菌大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的特異性檢測，是一種基于FRET(Fluorescence resonance energy transfer，熒光共振能量轉移)技術和細胞內鈣離子信號通路的B淋巴細胞生物傳感器的構建。

背景技術

在基于細胞的生物傳感器CBBs中，全細胞通常被用作一個初級傳感器，而二級傳感器的構建通常依賴于細胞信號檢測的類型。由于淋巴細胞卓越的特性及其巨大的應用潛力，在CBBs中已經應用了越來越多的淋巴細胞進行檢測。其中，B細胞由于其自身能特異性識別抗原和需要通過BCR(B cell receptor，B細胞受體)向T細胞進行抗原提呈的特性，在CBBs中顯示出了優越的檢測速度和檢測特異性。B細胞是已知天然的最快速的致病菌識別元件，其固有反應時間小于1秒。當B細胞識別致病菌后，BCR會介導鈣離子回流，該反應是B細胞應對抗原刺激的一個關鍵反應。當發生二價抗原或多價抗原與BCR的交聯后，便會導致跨膜信號轉導和抗原內化后的提呈。因為鈣離子在調控不同的細胞活動時有著重要作用，因此使用熒光指示劑的鈣離子成像在原代細胞和組織中的生理學研究具有越發重要的作用。遺傳編碼的鈣離子指示劑(Genetically encoded Ca²⁺ indicators，GECIs)是綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)技術的最大受益者之一，它是將熒光蛋白與生物鈣離子傳感器串聯得到的。GECIs已經成為了繼水母蛋白和化學鈣離子指示劑之后，檢測胞內鈣離子濃度時的一種非常有價值的工具。基于GFP構建的鈣離子指示劑可以很好地克服水母蛋白和化學合成指示劑的不足。其中一個高效的自組裝的GECI是TN-XXL。TN-XXL鈣離子生物傳感器是由來源于骨骼和心肌的鈣離子結合蛋白肌鈣蛋白(troponin C，TnC)衍生而來的，它已經被成功地應用于大量研究中，諸如從果蠅和小鼠的神經細胞直到小鼠的T細胞。據我們所知，還沒有TN-XXL被用于B細胞檢測食源性微生物中。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種基于FRET技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于FRET技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法，依次包括以下步驟：

1)、培養B細胞：將B細胞培養至指數生長期；

2)、將遺傳編碼鈣離子熒光指示劑質粒TN-XXL電轉化入指數生長期的B細胞，得表達TN-XXL的B細胞；

該表達TN-XXL的B細胞作為基于FRET檢測大腸桿菌O157:H7的細胞生物傳感器；

3)、將表達TN-XXL的B細胞與待測物接觸時，通過光漂白法測定FRET效率；

當大腸桿菌O157:H7細菌濃度高時，所檢測到的FRET效率相對較高。

作為本發明的基于FRET技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法的改進：

步驟1)中使用的B細胞培養基為DMEM培養基與HIFBS(熱滅活胎牛血清)按照9:1的體積比混合而得。

所述DMEM培養基為含有4mM L-谷氨酰胺和1.5g/L的碳酸氫鈉，4.5g/L的葡萄糖，1vol％的非必須氨基酸(MEM NAA)的DMEM培養基。

作為本發明的基于FRET技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法的進一步改進：步驟2)中，取指數生長期生長的B細胞，使用電轉化技術將質粒TN-XXL轉染到B細胞中(Bio-Rad Gene-Pulser,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)，電轉化時使用0.35mL濃度為1.43×10⁶cells/mL的B細胞和3μg的TN-XXL質粒DNA，電轉化的工藝參數為：0.4cm電轉化杯，500v(Bio-rad Gene Pulser XcellTM Electroporation Systems)。

本發明構建一種新型的細胞生物傳感器，它利用遺傳編碼鈣離子指示劑TN-XXL對胞內鈣離子的靈敏性和B細胞對致病菌反應的快速性，結合FRET技術，提供一種檢測食源性致病菌E.coli O157:H7的新的檢測方法。該方法是一種全新的細胞生物傳感器的構建方法(圖1)。