[發明專利]檢測MOG?IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件制備、CBA檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710475457.1
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107299111A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 魏世輝;艾南平
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;G01N33/68
• 代理公司: 北京智沃律師事務所11620
• 代理人: 王屹東

1.一種檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：

S1：MOG質粒構建：從人的體細胞中抽提總mRNA，并反轉錄成cDNA，設計MOG特異性PCR引物，擴充出全長MOG cDNA，并將該MOG cDNA連接到質粒載體上進行轉化，擴增抽提，得到MOG質粒；

S2：過表達MOG基因的慢病毒包裝：將MOG質粒和作為對照的空載體質粒分別與病毒包裝體系質粒共轉染進細胞中；轉染后，獲得病毒感染細胞，即得到過表達MOG的病毒顆粒和由空載體質粒轉染所得到的不表達MOG的對照病毒顆粒；

S3：過表達MOG基因的細胞株構建：接種細胞，用上述所得的過表達MOG的病毒顆粒和不表達MOG的對照病毒顆粒分別感染所接種的細胞；感染后，篩選過表達MOG-293T細胞株與Vector-293T細胞株，將其進行凍存保種；

S4：MOG-IgG CBA檢測用細胞爬片組件的制備

①接種步驟S3中所得到的過表達MOG-293T細胞株與Vector-293T細胞，并保證二者接種的細胞量相近；②待細胞融合度達到80-100％，除去培養Vector-293T細胞和過表達MOG-293T細胞株的培養基，加入多聚甲醛，0～10℃固定過夜；③PBS洗滌細胞，風干，則MOG-IgG CBA檢測用細胞爬片組件制備完成。

2.根據權利要求1所述的檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：步驟S1中，所述的MOG特異性PCR引物的正向引物序列為：ATGGCAAGC TTATCAAGACCC，反向引物序列為：GAAGGGATTTCGTAGCTCTTC。

3.根據權利要求2所述的檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：步驟S1中，所述MOG質粒構建的具體過程為：(1)以人神經少突膠質細胞為材料，抽提總mRNA，并利用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA；(2)設計MOG特異性PCR引物，擴充出全長MOG cDNA，并將所得MOG cDNA進行克隆，然后連接到質粒載體上，所述質粒載體為pLVX-IRES-mcherry慢病毒質粒載體；(3)將質粒進行轉化、搖菌，擴增抽提，得到MOG質粒。

4.根據權利要求1所述的檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：在步驟S2中，所述過表達MOG基因的慢病毒包裝的過程為：

接種HEK293T細胞，待細胞融合度達到80-90％，借助轉染試劑，將所得的MOG質粒和作為對照的空載體質粒pLVX-IRES-mcherry分別與病毒包裝體系質粒psPAX2和PMD2.G均按照質量比2:2:1的比例一起共轉染至HEK293T細胞；轉染40～55小時后，收取含病毒顆粒的細胞培養基上清；上清經超濾法濃縮，獲得濃縮后高滴度的病毒顆粒，即病毒感染細胞；然后進行病毒滴度驗證，確保病毒滴度合格，則得到過表達MOG的病毒顆粒和不表達MOG的對照病毒顆粒。

5.根據權利要求1所述的檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：在步驟S3中，所述過表達MOG基因的細胞株構建過程為：

接種HEK293T細胞，待細胞融合度達到40-50％，借助感染試劑，用步驟S2中所得的過表達MOG的病毒顆粒和不表達MOG的對照病毒顆粒分別感染HEK293T細胞；感染48～72小時后，進行抗生素篩選，并采用未進行病毒轉染的HEK293T細胞做為抗生素篩選對照組，當對照組的HEK293T細胞被安全殺死后，完成篩選，則篩選好的細胞即為過表達MOG-293T穩定細胞株與Vector-293T細胞株。

6.根據權利要求5所述的檢測MOG-IgG的CBA試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，其特征在于：在步驟S3中，所述的轉染試劑為聚凝胺，其能夠加強病毒的感染效率；感染48～72小時后，進行抗生素嘌呤霉素篩選；接種HEK293T細胞的培養基為成分以及各種成分的加量為：DMEM培養基+10％胎牛血清+1000U青霉素+1000mg/L鏈霉素；

在步驟S4中，培養Vector-293T細胞和過表達MOG-293T細胞株的培養基均為：DMEM培養基+10％胎牛血清+1000U青霉素+1000mg/L鏈霉素。