[發明專利]一種環境化學品對大鼠甲狀腺系統影響的測定方法

在審

• 申請號: 201710475190.6
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107937551A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 宮玉峰;張海軍;耿檸波;陳吉平
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明屬于化學品毒性評價領域，涉及一種基于分子生物學的評估方法，通過環境化學品對甲狀腺信號通路的改變來評估小劑量環境化學品的甲狀腺干擾效應。

背景技術

甲狀腺激素對于動物生長發育、代謝調控具有重要作用。研究發現，一些外源化合物能夠對生物體甲狀腺系統產生影響，干擾體內甲狀腺激素穩態，這類外源化學物質被稱為甲狀腺干擾物。目前，已發現百余種甲狀腺干擾物，包括高氯酸鹽、多氯聯苯、多環芳烴、多溴聯苯醚、雙酚A類及多種有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類農藥等。隨著經濟的快速發展，每天都有大量的新型化學品(如工業化學品、農藥、藥物及個人護理用化學品、阻燃劑等)被開發出來，這些化學品已成為影響人體與生態健康的重要風險源。因此，在其流入市場之前，評估這些化學品對哺乳動物甲狀腺系統的潛在影響，從而實現有效的風險防控具有深遠的意義。

甲狀腺干擾物對生物體甲狀腺系統影響的途徑較多，例如干擾甲狀腺激素的合成與轉運，干擾甲狀腺激素在外周組織中的代謝轉化，干擾甲狀腺激素的降解清除以及干擾甲狀腺激素與受體結合等。目前，雖然有多種技術手段可以對甲狀腺干擾效應進行評估，如非洲爪蟾尾吸收實驗、甲狀腺運載蛋白競爭結合實驗、模擬計算等，但由于甲狀腺干擾物毒性作用方式的復雜性，尚未有技術方法能夠系統、全面的評估外源化合物對哺乳動物甲狀腺系統的影響。

本發明基于分子生物學構建了一種環境化學品對哺乳動物大鼠甲狀腺系統影響的評估方法。該方法不僅分析了環境化學品對甲狀腺激素含量的影響，還從甲狀腺激素合成、轉運、代謝、降解清除及功能發揮等方面構建了哺乳動物甲狀腺信號通路。通過分析環境化學品對甲狀腺激素水平及甲狀腺信號通路的影響情況，全面直觀的分析外源化合物的甲狀腺干擾效應，是一種理想的評價手段，具有系統、全面的特點。

發明內容

本發明的目的是提供一種評估環境化學品對大鼠甲狀腺系統干擾的方法。利用酶聯免疫吸附試驗對大鼠血漿甲狀腺激素水平進行快速分析，利用高度特異性的熒光實時定量PCR方法對甲狀腺激素合成、轉運、代謝、作用發揮及降解清除等相關基因表達水平進行有效分析，基于分子生物學構建了甲狀腺激素信號通路，用于評估環境化學品暴露對大鼠甲狀腺系統的影響。該方法具有獲得信息全面、重復性好、特異性強等優點，能直觀的分析環境化學品對大鼠甲狀腺系統的影響。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

基于分子生物學實驗方法，以大鼠為實驗材料，通過暴露測試物(環境化學品)，分析大鼠血漿甲狀腺激素含量的變化以及與甲狀腺激素合成、轉運、代謝、功能發揮、降解清除有關的基因表達水平的變化，構建環境化學品甲狀腺干擾效應的毒性作用通路，評估其對大鼠甲狀腺系統的影響。

具體包括以下步驟：

以雄性Sprague Dawley品系大鼠為材料，首先進行化學品暴露實驗，步驟如下：控制體重為180～240g，6～10周齡，平分為4組；暴露實驗進行之前在屏障系統內進行適應檢查，給藥期間動物單籠飼育，飼育方式為每日經口灌胃一次，連續7～28天；給藥期間，動物自由攝食飲水；動物解剖前禁食過夜，不限制飲水；采用戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部大動脈取全血樣移入5mL離心管中儲存，并使用肝素鈉抗凝；采血結束后對動物進行系統解剖，取出動物的甲狀腺、肝臟等臟器，并剝去任何粘附的組織，-80℃低溫保存。

隨后，對獲得的血樣進行離心處理，4000rpm離心10～15min；利用酶聯免疫吸附試驗方法對其中的甲狀腺素(T₄)、三碘甲腺原氨酸(T₃)、游離甲狀腺素(FT₄)及游離三碘甲腺原氨酸(FT₃)含量進行定量分析。計算各組數據平均值，將試驗組與對照組的數據平均值進行T檢驗比較。若P值小于0.05且試驗組數據平均值大于對照組數據平均值，說明該每天暴露量的環境化學品暴露升高了甲狀腺激素水平，引起甲亢；若P值小于0.05且試驗組數據平均值小于對照組數據平均值，說明該每天暴露量的環境化學品暴露降低了甲狀腺激素水平，引起甲減；若不滿足上述條件，說明該每天暴露量的環境化學品暴露未對甲狀腺激素水平產生影響。

最后，對組織樣本甲狀腺激素相關基因表達水平的定量分析分3步完成。