[發明專利]一種干酪乳桿菌來源的D?乳酸脫氫酶及其應用

在審

• 申請號: 201710474276.7
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107177563A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 李劍芳;李雪晴;劉艷;袁風嬌;鄔敏辰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種干酪乳桿菌來源的D-乳酸脫氫酶及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

手性α-羥基酸是合成許多藥物、化學材料的重要前體物質。例如，苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)又名2-羥基-3苯基丙酸，存在兩種對映異構體，D-PLA和L-PLA。D/L-PLA均具有廣譜且高效的抑菌活性，是一種新型天然生物防腐劑，可作為飼料添加劑替代畜禽飼料的抗菌劑。

D-乳酸脫氫酶(D-Lactate dehydrogenase，D-LDH，EC 1.1.1.28)，是脫氫酶中十分重要且研究較多的一種酶，也是生物體內糖酵解途徑中一種關鍵的氧化還原酶。已有研究發現多種D-LDH可不對稱還原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)生成D-PLA，如來源于Pediococcus acidilactici和Pediococcus pentosaceus的PaLDH和PpLDH，Lactobacillus plantarumWCFS1中的D-LDH及Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842中的D-nLDH等。但是不同的D-LDH不對稱還原PPA的能力存在明顯差異，胡發根等利用來源于Lactobacillus plantarum的重組LDH將55mM PPA在1h內轉化生成了30.5mM D-PLA，摩爾轉化率為54.5％，光學純度達到100％。而來源于Lactobacillus bulgaricus的D-nLDH突變體偶聯甲酸脫氫酶后可將50mM PPA在90min內完全轉化，其D-PLA產率為99.0％，ee_p>99.9％。因此，為獲得高純度，高產量的D-PLA，利用分子生物學手段不斷挖掘出性狀優良的D-LDH，具有重要的工業化應用價值。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種來源于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的D-乳酸脫氫酶，命名為LcLDHD，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼所述D-乳酸脫氫酶的基因LcldhD。

在本發明的一種實施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達SEQ ID NO.1所示基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)為載體。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主為E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

本發明的第四個目的是提供構建所述基因工程菌的方法，是將SEQ ID NO.1所示基因與載體連接，轉化至大腸桿菌細胞中。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為pET-28a(+)。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主為E.coli BL21(DE3)。

本發明的第五個目的是提供生產所述乳酸脫氫酶的方法，是將所述基因工程菌接種至LB培養基中，培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入終濃度為0.4～0.5mmol/L的IPTG誘導6～10h。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導是在24～28℃進行誘導。

本發明的第六個目的是提供所述D-乳酸脫氫酶的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用是以苯丙酮酸為底物，加入所述D-乳酸脫氫酶，轉化生產D-苯乳酸。

在本發明的一種實施實施方式中，所述應用是向每1mmol苯丙酮酸中加入2～8mg含的該D-乳酸脫氫酶的重組菌的濕菌體，于30～37℃，200～220rpm條件下反應20～60min。

有益效果：本發明構建的重組菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a(+)-LcldhD可將10mmol/L苯丙酮酸在40min內完全不對稱還原生成9.91mmol/L PLA，產率為99.1％，對映體過量值(ee_p)為98.3％，相比于現有技術，在反應時間縮短一倍以上的同時，轉化率提高，取得了預料不到的技術效果。

附圖說明