[發(fā)明專(zhuān)利]一種菜豆來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710474254.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164342A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;李闖;宗迅成;王瑞;李劍芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/14;C12N15/55;C12N1/21;C12P41/00;C12P17/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種菜豆來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，。

背景技術(shù)

手性純的環(huán)氧化物及其對(duì)應(yīng)的水解產(chǎn)物鄰二醇被認(rèn)為是一類(lèi)具有高附加值的多功能手性砌塊，在手性藥物和精細(xì)化學(xué)品的合成中應(yīng)用廣泛。然而，在一些手性環(huán)氧化物的制備過(guò)程中，Sharpless不對(duì)稱(chēng)環(huán)氧化、Jacobsen環(huán)氧化等化學(xué)法的反應(yīng)結(jié)果往往無(wú)法達(dá)到期望的手性純度，產(chǎn)物(指保留下來(lái)的單構(gòu)型環(huán)氧化物和生成的二醇)的對(duì)映體過(guò)剩率(Enantiomeric excess,ee)值通常只有30％～80％，而且所使用的重金屬等催化劑也給環(huán)境帶來(lái)巨大的威脅。近年來(lái)，生物酶所介導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)拆分和對(duì)映體歸一性水解法因其較為專(zhuān)一的立體選擇性而逐漸走進(jìn)人們的視野，環(huán)氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH,EC 3.3.2.x)就是其中一類(lèi)重要的酶，該酶可以催化環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)水解，使水分子立體選擇性地加成到環(huán)氧化物的含氧三元環(huán)上，生成相應(yīng)的1,2-二醇，是一種典型的α/β折疊型水解酶。EH來(lái)源廣泛、反應(yīng)無(wú)需輔因子、底物譜廣、反應(yīng)條件溫和，被認(rèn)為是一種頗具開(kāi)發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值的生物催化劑。

目前，人們已經(jīng)從動(dòng)物、植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了300多種EH，并根據(jù)酶的亞細(xì)胞定位及底物的特異性將其劃分為七個(gè)亞家族，其中可溶性環(huán)氧化物酶是當(dāng)前研究較多的EH之一。Bellucci等研究了存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)微粒體環(huán)氧化物水解酶的立體化學(xué)特性，利用其催化水解一些β烷基取代的環(huán)氧苯乙烷衍生物，結(jié)果得到對(duì)應(yīng)的R型二醇。胡蝶等從宇佐美曲霉中成功發(fā)掘出一種新型的環(huán)氧化物水解酶AuEH2，發(fā)現(xiàn)其對(duì)R型環(huán)氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的親和性較S型的高，認(rèn)為該酶在外消旋(rac-)SO的手性拆分反應(yīng)中具有很大的應(yīng)用潛力。較之上述幾種來(lái)源，植物EH則更加容易獲得且原料也較為廉價(jià)。當(dāng)前已經(jīng)在包括大豆(Glycine max)、木豆(Cajanus cajan)、蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)等植物基因組中確定了編碼EH的開(kāi)放閱讀框，其中研究最深入的是馬鈴薯EH，其晶體結(jié)構(gòu)早在2006年就已通過(guò)X射線(xiàn)衍射圖譜的解析獲得。最近，許建和課題組從綠豆(Vigna radiata)中發(fā)現(xiàn)的兩種EH(MbEHA,MbEHB)在以對(duì)硝基環(huán)氧苯乙烷為底物的情況下表現(xiàn)出互補(bǔ)的對(duì)映選擇性，引起了相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。

迄今報(bào)道的環(huán)氧化物水解酶雖然均具有一定的不對(duì)稱(chēng)水解環(huán)氧化物的活性，但是目前僅有40余種EH針對(duì)于一種或多種環(huán)氧化物表現(xiàn)出高的對(duì)映選擇性(即對(duì)映選擇率E值>30)，據(jù)我們所知，除國(guó)外學(xué)者研究的馬鈴薯EH之外，目前尚無(wú)植物來(lái)源的EH可以高效的拆分rac-SO制備高手性純的R-SO，因此，通過(guò)分子生物學(xué)手段挖掘能夠表達(dá)具有高選擇性的EH基因構(gòu)建其表達(dá)體系，并將其應(yīng)用于光學(xué)純環(huán)氧化物的制備等研究工作具有著重要經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種環(huán)氧化物水解酶PvEH2，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有環(huán)氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述環(huán)氧化物水解酶PvEH2的基因，基因命名為pveh2，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該序列全長(zhǎng)951bp，編碼316個(gè)氨基酸。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于生產(chǎn)R-環(huán)氧苯乙烷的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌為宿主，表達(dá)SEQ ID NO.2所示的環(huán)氧化物水解酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌以pET-28a(+)為載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌以E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10為宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌是按如下方法構(gòu)建的：(1)擴(kuò)增SEQ ID NO.1所示序列，在基因兩端引入限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和Xho I的酶切位點(diǎn)；(2)用上述兩種內(nèi)切酶分別處理SEQ ID NO.1所示序列和表達(dá)載體pET-28a(+)，并將上述酶解消化產(chǎn)物在17℃連接過(guò)夜，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-pveh2；(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，即可得到重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-pveh2。