[發明專利]金銀花克隆LjHQT基因、克隆方法、植物表達載體及用途

在審

• 申請號: 201710474027.8
• 申請日: 2017-06-21
• 公開（公告）號: CN107099543A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 蒲高斌;魏麗;李佳;劉謙;張永清
• 申請（專利權）人: 山東中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 張祥明

技術領域

本發明涉及一種金銀花克隆LjHQT基因。屬于基因克隆技術領域。

背景技術

HQT基因產物是綠原酸生物合成途徑中的關鍵酶之一。2008年，Rommens等對馬鈴薯塊莖特異表達經過修改的MYB轉錄因子基因StMtf1M，激活了苯丙醇生物合成途徑，使綠原酸的含量大幅提高，并同時檢測到奎尼酸-羥肉桂酰基轉移酶基因(HQT)的表達顯著上升。Carla Clé等將番茄在溫室內培養，并對其HQT基因進行表達調控，HQT高表達的番茄葉綠原酸含量最高，而野生型次之，HQT基因沉默的番茄葉綠原酸含量最低。他們發現HQT高表達的番茄葉綠原酸含量是野生型的2.5倍，并最終得出了HQT對番茄葉中綠原酸含量的積累起到關鍵作用的結論，這也與Niggeweg等的結論一致。再一次證實了HQT的表達量與番茄中綠原酸的含量直接相關。

綜上所述，金銀花中高含量的綠原酸及其同屬植物中HQT的發現，以及HQT與多種植物綠原酸的生物合成密切相關，HQT表達量的增減往往伴隨著綠原酸含量的升降這一事實，預示著金銀花植物體內極有可能存在HQT基因的表達，并且它與金銀花中綠原酸的積累密切相關。

發明內容

本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種金銀花克隆LjHQT基因。

本發明還提供了上述基因的克隆方法，利用上述基因構建的植物表達載體。

本發明還提供了上述基因的用途。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

金銀花克隆LjHQT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)提取金銀花RNA，反轉錄獲得cDNA；

(2)參照其他植物HQT保守區設計簡并引物，以cDNA為模板，進行PCR擴增，獲得核心序列；簡并引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)通過RACE方法從核心序列克隆全長cDNA序列，即為LjHQT基因。

簡并引物的序列如下：

P1：5'-GACTHTGCYTAARGHTNGC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

P2：5'-CACHCCAATCAHTCCYTCNCCNGt-3'，如SEQ ID NO.4所示；

其中，N代表任意一種核苷酸；R代表A或G；Y代表C或T；H代表A或C或T。

作為優選的技術方案之一，步驟(1)中，RNA的提取對象為金銀花幼葉片。

作為優選的技術方案之一，步驟(2)中，所述其他植物為馬鈴薯、番茄、煙草或咖啡。

作為優選的技術方案之一，步驟(2)中PCR擴增使用Ex Taq酶，擴增程序如下：95℃變性4分鐘后，依次進行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30個循環，最后于72℃延伸15分鐘。

作為優選的技術方案之一，步驟(2)中所得核心序列為860bp。

作為優選的技術方案之一，步驟(3)所得LjHQT基因全長1,621bp，其中包括1,320bp的編碼區、209bp的5’非翻譯區和一個包含18個多聚腺苷酸尾的92bp 3’非翻譯區，與其他植物HQT的同源性介于42～71％之間。

一種利用上述基因構建的植物表達載體。

作為優選的技術方案之一，所述植物表達載體是利用Gateway技術構建得到的。

上述基因的用途，利用上述基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗病性轉基因植物。

本發明的有益效果：

本發明從金銀花中克隆酰基轉移酶基因LjHQT，與其他植物HQT的同源性介于42～71％之間。經試驗驗證，LjHQT對奎尼酸的親和力更高。在香豆酰輔酶A飽和時，LjHQT對奎尼酸的親和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。LjHQT能顯著提高轉基因株系中綠原酸含量，有效提高轉基因植株的抗病性。

附圖說明

圖1是金銀花LjHQT與其他植物HQT的序列比對(CAE46932，煙草；ABK79689，刺棘薊；ABO77956，咖啡；AEK80405，金銀花)；

圖2是LjHQT系統發育分析；

圖3是LjHQT的Southern blot雜交分析；

圖4A～圖4C是LjHQT原核表達載體的構建及分子檢測；

圖5是SDS-PAGE分析金銀花LjHQT誘導表達及純化回收情況；