[發明專利]重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710472742.8
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107227311B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 吳健敏;劉金鳳;杜毅超;覃紹敏;白安斌;林俊;陳鳳蓮;唐海波;馬玲;楊磊
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N7/04;A61K39/23;A61P31/20
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了一種重組豬細小病毒樣粒子，將TAT蛋白轉導域與形成PPV空衣殼蛋白所需的抗原VP2基因連接起來，克隆到桿狀病毒轉移載體獲得同源重組載體，包裝產生含有PPV VP2蛋白和TAT蛋白轉導域的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞，表達融合了PPV VP2蛋白和TAT蛋白轉導域的重組TAT?VP2蛋白，形成病毒樣粒子(VLPs)。研究表明，本發明的重組病毒樣粒子輔以佐劑接種動物，可有效刺激PPV特異性抗體產生，提高淋巴細胞產生細胞因子能力。因此，應用本發明可研制具有良好免疫效果的新型高效PPV亞單位疫苗。

技術領域

本發明屬于豬細小病毒技術領域，尤其涉及一種重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用。

背景技術

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體，母豬孕前期受PPV感染、經胎盤使胚胎或胎兒受到侵襲，引起初產母豬不孕、流產、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊等，同時還可引起仔豬的皮炎和腹瀉，給養豬業造成了極大的經濟損失。近年來，PPV感染呈現擴大、上升的趨勢，在全國范圍內流行，遍及二十多個省、市，血清學調查陽性率普遍高達50％-80％，PPV儼然已成為豬重要的傳染病之一，極大制約了我國養豬業的健康發展。

眾所周知，畜禽重大疫病的防控關鍵都在于疫苗免疫，同樣免疫接種是防控PPV的主要手段。目前，我國市場上已有包括哈獸研、上海農科院、武漢科前等多家單位研制的滅活疫苗上市，這些疫苗在一定程度上控制了我國PPV的流行，但其存在免疫持續時間短，抗體水平較低，免疫副作用大等缺陷，造成免疫效果常不盡人意。弱毒苗和DNA疫苗因其安全性和技術瓶頸難以突破等原因還處于研發階段。因此，克服目前PPV活苗、滅活苗以及基因工程疫苗缺點，尋找新的技術策略，研發一種安全、高效非復制的病毒疫苗是有效免疫防控PPV的重要科學前提。

病毒樣粒子(Virus-like particles，VLPs)，是由病毒主要衣殼蛋白或包膜蛋白自主包裝形成的空衣殼結構，在形態、結構及表面抗原和多肽表位與天然病毒粒子非常相似，作為免疫原，VLPs模仿了病毒粒子的真實結構，比其它類型的亞單位疫苗更容易被免疫系統識別，并且以更真實的構象被抗原遞呈細胞吞噬、加工和遞呈；而且VLPs結構與原病毒相似，就意味著與其它亞單位疫苗相比，低劑量就可以有效刺激產生和全病毒一樣的保護反應。此外，因VLPs不會產生任何可能導致感染的遺傳成分，具有安全性好等特點，因此，病毒樣粒子已經成為多種研究病毒疫苗的首選對象，成為今后病毒類疫苗研究的發展方向。目前，多種病毒樣粒子疫苗已進入臨床前期試驗，其中由桿狀病毒表達系統產生的乙型肝炎病毒VLPs和人乳頭瘤病毒VLPs在美國已被批準上市。此外還有戊型肝炎VLPs疫苗等多個品種在臨床研究中，顯示出該類疫苗的巨大潛力。研究證實，VP2蛋白是PPV的主要衣殼蛋白和主要的抗原表位聚集區，可自我組裝形成病毒樣顆粒，在病毒感染細胞過程中參與病毒DNA的包裝形成具有感染性的病毒粒子。TAT蛋白轉導域具有強大的蛋白轉導功能，能把與之融合的蛋白、DNA等物質跨膜轉運到細胞內，并在細胞間傳遞，同時保留所攜帶外源物質的生物活性。近年來，應用蛋白轉導域來增強動物疫苗免疫效果的報道屢見不鮮，蛋白轉導域促進所攜帶蛋白的細胞提呈作用已證實。因此，TAT蛋白轉導域在動物疫苗領域有著廣泛的研究和應用價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：TAT-VP2融合基因，該基因由融合PPV VP2蛋白基因和2段TAT蛋白轉導域核苷酸序列形成且具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列。

上述TAT-VP2融合基因在制備預防豬細小病毒病(PPVD)疫苗中的應用。

重組豬細小病毒樣粒子，該病毒樣粒子由融合PPV VP2蛋白基因和2段TAT蛋白轉導域核苷酸序列形成的TAT-VP2融合基因所編碼，且病毒樣粒子具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。