[發明專利]一種大量組織、細胞樣本mRNA的分子條形碼標記、文庫構建、測序的方法

在審

• 申請號: 201710472582.7
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107502607A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 歐陽宏偉;吳兵兵;李余;潘宗友;安晟銳;劉怡孝;鄒曉暉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;C40B70/00;C40B50/06
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 張會雪

1.一種用于對大量組織、細胞樣本信使核糖核酸逆轉錄的含分子條形碼的寡核苷酸引物序列組合，其特征在于：該序列組合含多個不同且唯一的條形碼及oligo-dT的寡核苷酸鏈。

2.根據權利要求1所述的寡核苷酸引物序列組合，其特征在于：所述寡核苷酸鏈為：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子條形碼(barcode)序列，一個X代表ATGC四種脫氧核糖核酸堿基中的任意一個堿基，N為6-8，Z1為任意illumina i5測序引物序列，T(18-30)為18-30個連續脫氧核糖核酸T堿基。

3.一種通過逆轉錄對大量組織、細胞樣本mRNA分子進行條形碼標記的方法，其特征在于：該方法包括：

mRNA的提取、mRNA添加分子條形碼、逆轉錄：每個樣本加入含唯一且不同條形碼及oligo-dT的寡核苷酸鏈作為特異逆轉錄引物，進行逆轉錄，其中所述寡核苷酸鏈為：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子條形碼序列，一個X代表ATGC四種脫氧核糖核酸堿基中的任意一個堿基，N為6-8，Z1為任意illumina i5測序引物序列，T(18-30)為18-30個連續脫氧核糖核酸T堿基。

4.一種用于對大量組織、細胞樣本構建3’端二代測序文庫的方法，其特征在于：所述大量組織、細胞樣本是含polyA尾巴的mRNA的真核生物的正常或異常病變的組織、細胞樣本，該方法包括如下步驟：

1)、mRNA的提取；

2)、mRNA添加分子條形碼、逆轉錄：每個樣本加入含唯一且不同條形碼及oligo-dT的寡核苷酸鏈作為特異逆轉錄引物，進行逆轉錄，其中所述寡核苷酸鏈為：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子條形碼序列，一個X代表ATGC四種脫氧核糖核酸堿基中的任意一個堿基，N為6-8，Z1為任意illumina i5測序引物序列，T(18-30)為18-30個連續脫氧核糖核酸T堿基；

3).合成第二條cDNA鏈

將大量標記有不同barcode序列的樣本通過內參基因熒光定量QPCR檢測每個樣本的相對摩爾濃度；

根據每個樣本的相對摩爾濃度，將標記有不同條形碼的逆轉錄產物等摩爾濃度混合，并經AMPure XP磁珠純化；將混合、純化后的逆轉錄產物，利用NEB第二條cDNA鏈合成試劑盒合成第二條cDNA的鏈。

4)文庫構建

首先將大量標記有不同barcode序列的雙鏈cDNA樣本，經AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)純化后，根據樣本濃度，將其用TE(Tris,EDTA,PH7.4)稀釋至0.2-1ng/μl，取1.25μl，加入3.75μl預混液[Nextera XT(Illumina)試劑盒中的Tagment DNA Buffer(2.5μl)和Amplification Tagment Mix(1.25μl)],渦旋20s，3000g離心5min后，在PCR儀上反應[55℃,10min；10℃,5min]；等溫度降到10℃后，馬上在反應體系中加入1.25μl NT Buffer終止反應；渦旋20s，3000g離心5min；然后在上述反應體系中依次加入：3.75μl Nextera PCR Master Mix(NPM)，1.25μl的i5端PCR引物，1.25μl i7引物，渦旋20s，3000g離心2min后，在PCR儀上反應[72℃,3min；95℃,30s；12循環(95℃,10s；55℃,30s；72℃,60s)；72℃,5min；10℃,5min；]；上述為總反應體系12.5μl，當對最終測序文庫的產量需求較大，根據實際需求按倍數放大上述建庫反應中每一步的試劑的體積。

5.根據權利要求4所述的用于對大量組織、細胞樣本構建3’端二代測序文庫的方法，其特征在于：所述的i5端PCR引物序列為AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-Z2,Z2為步驟2對應的illumina i5測序引物Z1的5’端部分14-20個堿基序列；所述的i7引物為Nextera XT(Illumina)試劑盒的i7引物序列。