[發(fā)明專利]一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710470525.5
• 申請(qǐng)日: 2017-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN107058393B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 耿毅;余澤輝;鄧釗賓;汪開毓;陳德芳;歐陽萍;黃小麗;楊澤曉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N1/21;C12R1/63
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌遺傳重組方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以擬態(tài)弧菌SCCF01株基因組為模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物對(duì)擴(kuò)增目的基因上臂序列和下臂序列；以PKD4質(zhì)粒為模板，使用Kan引物對(duì)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因片段；

2)將擴(kuò)增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段進(jìn)行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR產(chǎn)物；

3)將步驟2)獲得融合PCR產(chǎn)物與受體擬態(tài)弧菌SCCF01株進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，經(jīng)過對(duì)抗性標(biāo)記基因的篩選，獲得擬態(tài)弧菌SCCF01株的缺失株；

步驟1)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系均為：5×PrimeBuffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM特異性的引物對(duì)上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 32.5ul；

步驟1)中的PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35個(gè)循環(huán)72℃延伸10min；

所述目的基因?yàn)門LH基因，其對(duì)應(yīng)的目的基因上臂和目的基因下臂引物對(duì)分別是TLH-UP和TLH-DOWN引物對(duì)，所述TLH-UP引物對(duì)包括TLH-UP-F和TLH-UP-R，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述TLH-DOWN引物對(duì)包括TLH-DOWN-F和TLH-DOWN-R，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Kan引物對(duì)包括Kan-F和Kan-R，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

步驟2)中的融合具體為：

第一步PCR反應(yīng)體系：5×PrimeBuffer 5μl，dNTP Mixture 2μl，模板各1μl，模板包括卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段膠回收產(chǎn)物，2.5U/μlDNA Polymerase 0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

第二步PCR反應(yīng)體系5×PrimeBuffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM目的基因上臂序列上游引物和目的基因下臂序列下游引物各1μl，模板1μl，模板為第一步反應(yīng)PCR產(chǎn)物，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39個(gè)循環(huán)72℃延伸10min；

步驟3)中的自然轉(zhuǎn)化具體為：

3.1)將保存于-80℃的擬態(tài)弧菌SCCF01株復(fù)蘇于LB培養(yǎng)基或者接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，含30℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于10ml LB液體培養(yǎng)基，在30℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4，將5ml菌液8000×g離心5min，棄上清后使用1ml滅菌無葡萄糖M9培養(yǎng)液洗滌一次后，再用1ml無葡萄糖M9培養(yǎng)液重懸，其中，無葡萄糖M9培養(yǎng)液中加入32mM MgSO₄和5mM CaCl₂；

3.2)向重懸菌加入80mg高溫滅菌后的幾丁質(zhì)，30℃孵育24h；

3.3)輕輕吸去孵育后的上清，重新加入1ml無葡萄糖M9培養(yǎng)液重懸和DNA總量大于500ng的重組片段PCR產(chǎn)物，30℃孵育24h，其中，無葡萄糖M9培養(yǎng)液中加入32mM MgSO₄和5mMCaCl₂；

3.4)將孵育后的細(xì)菌渦旋振蕩20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上篩選缺失株。

2.權(quán)利要求1所述的基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌遺傳重組方法在構(gòu)建擬態(tài)弧菌缺失株中應(yīng)用。