[發明專利]同時檢測三種魚類病毒的多重PCR引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201710469019.4
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN107190103B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 葛均青;楊金先;柯翎
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;呂元輝

本發明提供用于同時檢測鰻鱺皰疹病毒EHV、日本鰻鱺表皮細胞壞死病毒JEECV和花鰻鱺多瘤病毒AmPV的多重PCR引物組、試劑盒及檢測方法，本發明根據獲得的的核酸序列，設計用于擴增EHV，JEECV和AmPV的特異性引物，避免引物之間形成穩定的引物二聚體，并對引物擴增序列的特異性進行分析，獲得由6條核酸序列組成，可同時對EHV，JEECV和AmPV具有高的擴增靈敏性和特異性的引物組，包括：SEQ ID NO：1?6。本發明可在同一PCR反應體系中同時檢測和鑒別EHV，JEECV和AmPV，具有操作簡便，特異性強等優點；而且本發明可根據擴增長度的不同直接判定結果，更高效、實用。

技術領域

本發明屬于水產病害微生物檢測技術領域，具體涉及一種可同時檢測鰻鱺皰疹病毒(Eel herpesvirus，EHV)、日本鰻鱺表皮細胞壞死病毒(Japanese eel endothelialcells-infecting virus，JEECV)和花鰻鱺多瘤病毒(Anguilla marmorata polyoma-likevirus，AmPV)三種DNA病毒的多重PCR引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

我國是世界主要的鰻鱺養殖國家之一，其產值在我國的水產品出口貿易中占有重要地位。養殖的品種主要日本鰻鱺(A.japonica)、歐洲鰻鱺(A. anguilla)、美洲鰻鱺(A.rostrata)、花鰻鱺(A.Marmorata)。由于大規模的集約化養殖，重大病毒性疫病爆發日益頻繁，造成巨額的經濟損失。明確疾病的的致病病原是有效開展疾病防控的重要前提。我們率先在國內建立了多種鰻鱺病毒的檢測方法，開展了相關病毒的流行病學調查。鰻鱺皰疹病毒 (Eel herpesvirus,EHV)、日本鰻鱺內皮細胞壞死病毒(Japanese eelendothelial cells-infecting virus,JEECV)和花鰻鱺多瘤病毒(Anguilla marmoratapolyoma-like virus，AmPV)同屬于DNA病毒，這三種病毒對鰻鱺的致病性均表現為爛鰓、出血等癥狀，在臨床診斷上難以區分。我們分別建立了這三種病毒的PCR檢測方法，分別檢測耗時費力；同時，也多次發現它們有混合感染的情況。

EHV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，曾給多國歐洲鰻鱺和日本鰻鱺的養殖業者造成巨大經濟損失，其也是引起野生歐洲鰻鱺減少的重要因素。我們前期的研究表明，其可在歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、美洲鰻鱺和花鰻鱺上檢出。臨床和病理學研究表明，EHV可引起“爛鰓”、“脫粘”、“紅頭”等典型癥狀。但現有的PCR檢測都是根據EHV的DNA聚合酶基因序列設計引物，因DNA聚合酶基因高度保守，在檢測時可能會檢出鰻鱺虹彩病毒，表現為 EHV假陽性。

JEECV是一種雙鏈環狀DNA病毒，具有與多瘤病毒的大T抗原基因同源且高度保守的LTLG基因,是日本鰻鱺內皮細胞壞死病(Viral endothelial cell necrosis of eel,VECNE)的致病病原。自上世紀80年代，VECNE就經常爆發，給日本鰻鱺的養殖業者造成巨大經濟損失。其致病的典型癥狀包括鰻鱺的鰭條變紅，腹部膨脹，鰓、肝臟充血等。我們在國內首次建立了JEECV的PCR 檢測方法，并成功應用于疾病的診斷。

AmPV與JEECV一樣，具有多瘤病毒的LTLG基因。序列分析表明，我們從患病的花鰻鱺中擴增到的序列與中國臺灣分離的AmPV有較大差異，同源性為94％。AmPV可引起花鰻鱺爛鰓、體表出血等典型癥狀。

因此，亟需提供一種檢測這三種病毒的多重PCR引物組，發明檢測試劑盒及優化實驗條件，實現這三種病毒的同時檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種方便快捷、特異性強、準確率高、且能同時檢測鰻鱺皰疹病毒(Eel herpesvirus，EHV)、日本鰻鱺表皮細胞壞死病毒(Japanese eel endothelialcells-infecting virus，JEECV)和花鰻鱺多瘤病毒(Anguilla marmorata polyoma-likevirus，AmPV)的多重PCR檢測方法。